二甲雙胍促進(jìn)記憶性T細(xì)胞分化及增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的
　　免疫治療作為《科學(xué)》雜志評(píng)出的2013年十大突破之首，表現(xiàn)出對(duì)抗腫瘤的巨大潛力，也使之成為繼外科手術(shù)、放療、化療之后第四類已被證明具有顯著優(yōu)勢(shì)的抗腫瘤療法。其中，過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療已經(jīng)成為癌癥治療的重要手段之一，并在臨床試驗(yàn)中取得了顯著的治療效果。嵌合抗原受體T細(xì)胞（chimeric antigen receptor T cells, CAR-T）治療作為過(guò)繼免疫治療的新興力量，使T細(xì)胞能夠特異且有效地殺傷腫瘤

2、細(xì)胞，顯著改善患者的預(yù)后。
　　然而，無(wú)論是傳統(tǒng)的過(guò)繼免疫細(xì)胞療法還是新型的CAR-T療法，都尚未在實(shí)體瘤治療中取得突破性進(jìn)展。究其原因，一方面由于腫瘤微環(huán)境的存在影響T細(xì)胞的活化和代謝：（1）T細(xì)胞活化后抑制性受體上調(diào)，而腫瘤細(xì)胞通過(guò)表達(dá)相應(yīng)配體抑制 T細(xì)胞功能；（2）微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)性攝取葡萄糖，抑制 T細(xì)胞的糖酵解，進(jìn)而抑制 T細(xì)胞的分化和記憶性的形成。另一方面，由于體外擴(kuò)增培養(yǎng)的 T細(xì)胞大多處于終末分化狀態(tài)，難以在患

3、者體內(nèi)發(fā)揮持續(xù)、長(zhǎng)久的抗腫瘤效應(yīng)。如何獲得分化狀態(tài)低、抗腫瘤能力強(qiáng)的 T細(xì)胞是目前過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。因此，探討記憶性 T細(xì)胞分化的機(jī)制，獲得更多年輕化T細(xì)胞用于免疫治療的研究十分必要。
　　記憶性T細(xì)胞是一群異質(zhì)性細(xì)胞，包括干細(xì)胞樣T細(xì)胞（T memory stem cell, Tscm）、中心記憶性 T細(xì)胞（central memory cell, Tcm）和效應(yīng)記憶性 T細(xì)胞（effector memory c

4、ell, Tem）等。其中Tscm和Tcm亞群在體內(nèi)的增殖和抗腫瘤活性均優(yōu)于Tem和效應(yīng)性T細(xì)胞（effector T cell, Teff）。代謝檢測(cè)點(diǎn)和信號(hào)通路分子是調(diào)控記憶性 T細(xì)胞分化過(guò)程的關(guān)鍵因素。因而，探討如何通過(guò)體外藥物誘導(dǎo)干預(yù)獲得記憶性T細(xì)胞的研究已成為當(dāng)前熱點(diǎn)。AMPK是促進(jìn)記憶性T細(xì)胞形成的關(guān)鍵信號(hào)通路分子，也是T細(xì)胞重要的代謝檢測(cè)點(diǎn)，而臨床II型糖尿病的一線用藥二甲雙胍（metformin）能夠顯著激活A(yù)MPK通路

5、。二甲雙胍殺傷腫瘤細(xì)胞的研究已有報(bào)道，但是二甲雙胍能否通過(guò)激活A(yù)MPK促進(jìn)記憶性T細(xì)胞形成及增強(qiáng)其抗腫瘤效應(yīng)的機(jī)制尚不清楚。
　　肺癌在我國(guó)發(fā)生率和死亡率逐年增長(zhǎng)，使得肺癌超越其他惡性腫瘤成為致死率第一的腫瘤。盡管手術(shù)、化療、放療和靶向治療等治療手段和方案取得了較大進(jìn)展，但是肺癌患者的5年生存率僅為16.1％。目前，肺癌已經(jīng)發(fā)展成為我國(guó)公共健康的焦點(diǎn)問(wèn)題。盡管CAR-T細(xì)胞治療在實(shí)體瘤中取得了一定的療效，但是尚未有關(guān)于肺癌治療的研

6、究。此外，CAR-T細(xì)胞的持久性及記憶性影響其在體內(nèi)的生存和抗腫瘤效應(yīng)。因而，我們將以肺癌為模型探討二甲雙胍能否促進(jìn)CAR-T細(xì)胞的記憶性，增強(qiáng)CAR-T治療肺癌的效果。
　　本文主要探討了二甲雙胍通過(guò)激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制miR107的表達(dá)進(jìn)而增加轉(zhuǎn)錄因子Eomes的表達(dá)水平，促進(jìn)記憶亞群Tscm和Tcm細(xì)胞比例上調(diào)。同時(shí)，二甲雙胍促進(jìn)記憶性CAR-T細(xì)胞的形成及增強(qiáng)體、內(nèi)外對(duì)肺癌細(xì)胞的殺傷能力。進(jìn)一步驗(yàn)證二甲雙胍改善肺癌合

7、并糖尿病患的預(yù)后，促進(jìn)體內(nèi)記憶性細(xì)胞的形成，為臨床過(guò)繼性細(xì)胞免疫治療提供新的思路和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法
　　1）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者來(lái)源的CD8+ T細(xì)胞中各亞群的比例、表面標(biāo)志物表達(dá)和胞內(nèi)因子的分泌水平。
　　2）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)體外培養(yǎng)時(shí)二甲雙胍對(duì) CD8+T細(xì)胞分化和分泌胞內(nèi)因子水平的影響。
　　3）細(xì)胞免疫熒光分析二甲雙胍對(duì)CD8+T細(xì)胞PD-1表達(dá)的影響。
　　4）采用Annexin-V/PI雙染

8、法檢測(cè)二甲雙胍對(duì)CD8+T細(xì)胞凋亡的影響。流式分選Tscm和Tcm亞群，采用qRT-PCR檢測(cè)抗凋亡基因Bcl2和Bcl6的表達(dá)水平。
　　5）qRT-PCR法檢測(cè)T細(xì)胞分化相關(guān)基因和microRNA的表達(dá)水平。
　　6）Western blot檢測(cè)相關(guān)信號(hào)通路蛋白的表達(dá)。
　　7）雙熒光報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證miR107與Eomes的靶向關(guān)系。
　　8）利用海馬能量檢測(cè)系統(tǒng)分析T細(xì)胞的糖酵解水平。
　　9）構(gòu)建靶向

9、HER2抗原的CD8+CAR-T細(xì)胞，分析二甲雙胍對(duì)HER2-CAR T細(xì)胞分化和抗腫瘤活性的影響。
　　10）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)二甲雙胍處理的HER2-CAR T細(xì)胞對(duì)HER2高表達(dá)的靶細(xì)胞（A549和H460）以及HER2低表達(dá)的結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-116的殺傷作用。
　　11）對(duì)肺癌合并糖尿病患者進(jìn)行生存分析，探討二甲雙胍對(duì)肺癌患者預(yù)后的影響。
　　12）流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)肺癌患者外周血及腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞亞群比

10、例、表面標(biāo)志物的表達(dá)及胞內(nèi)因子的分泌水平。
　　13）采用免疫組化分析腫瘤浸潤(rùn)T細(xì)胞的PD-1表達(dá)水平。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　1）二甲雙胍在體內(nèi)促進(jìn)記憶性 T細(xì)胞形成。服用二甲雙胍后糖尿病患者CD8+Tscm和Tcm亞群比例增加。
　　2）二甲雙胍在體內(nèi)增強(qiáng)T細(xì)胞功能。服用二甲雙胍后，糖尿病患者CD8+T細(xì)胞表面PD-1和Tim-3的表達(dá)水平降低，IFN-??和IL-2的分泌水平增強(qiáng)。
　　3）體外培養(yǎng)中二甲

11、雙胍處理增加了記憶性CD8+ T細(xì)胞比例。二甲雙胍處理3d和7d時(shí)，Tscm和Tcm亞群比例升高。
　　4）二甲雙胍抑制CD8+T細(xì)胞的凋亡。二甲雙胍上調(diào)CD8+ T細(xì)胞及Tscm和Tcm細(xì)胞亞群抗凋亡基因Bcl2和Bcl6的表達(dá)水平。
　　5）二甲雙胍上調(diào)與記憶性相關(guān)基因如 Eomes和 AMPK的表達(dá)，降低與效應(yīng)性相關(guān)基因如Prdm1和T-bet的表達(dá)。轉(zhuǎn)錄因子Eomes的表達(dá)水平在二甲雙胍處理的T細(xì)胞中顯著升高。

12、>　　6）二甲雙胍激活A(yù)MPK信號(hào)通路，抑制其下游mTOR及S6通路。
　　7）AMPK抑制miR107上調(diào)Eomes的表達(dá)。
　　8）二甲雙胍降低CD8+T細(xì)胞糖代謝水平，有利于記憶性的形成和維持。
　　9）二甲雙胍促進(jìn)記憶性HER2-CAR T細(xì)胞的形成。HER2-CAR轉(zhuǎn)染T細(xì)胞效率達(dá)到70%以上，并上調(diào)Tscm和Tcm亞群的比例。
　　10）二甲雙胍增強(qiáng) HER2-CAR T細(xì)胞的抗腫瘤效應(yīng)。二甲雙胍能夠

13、增加HER2-CAR T細(xì)胞表達(dá)脫顆粒標(biāo)志物 CD107a的水平。同時(shí)促進(jìn) IFN-??和 IL-2的分泌、增強(qiáng)HER2-CAR T細(xì)胞殺傷A549和H460的能力，而對(duì)低表達(dá)HER2的結(jié)直腸癌細(xì)胞系HCT-116的殺傷功能較弱。
　　11）建立肺癌移植瘤模型，對(duì)荷瘤小鼠進(jìn)行治療發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍處理的HER2-CAR T細(xì)胞清除腫瘤效果更好。
　　12）二甲雙胍促進(jìn)肺癌患者記憶性 T細(xì)胞的形成。服用二甲雙胍的患者生存時(shí)間較對(duì)照

14、組患者延長(zhǎng)7個(gè)月以上，且外周血CD8+T細(xì)胞及TIL細(xì)胞中Tscm和Tcm亞群比例均較對(duì)照組Tscm和Tcm比例增加。
　　13）二甲雙胍降低肺癌患者T細(xì)胞表面PD-1的表達(dá)。服用二甲雙胍的患者外周血及腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞PD-1的表達(dá)水平均降低。
　　14）二甲雙胍增強(qiáng)促炎性細(xì)胞因子的分泌水平。二甲雙胍組患者外周血及腫瘤浸潤(rùn)的CD8+T細(xì)胞分泌的IFN-??和IL-2的水平均較對(duì)照組患者顯著增加。
　　結(jié)論