二甲雙胍促進(jìn)脊髓損傷大鼠運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)及其機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　創(chuàng)傷性脊髓損傷(Spinal cord injury，SCI)是一種嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，往往會(huì)永久性運(yùn)動(dòng)以及感覺功能的缺失，目前臨床上尚沒有一種公認(rèn)、有效的治療藥物。自噬作為一種細(xì)胞生理變化的基本過程，對(duì)抗細(xì)胞所受到的外界不良刺激，從而減少不良刺激對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的損害。最近的研究表明，在創(chuàng)傷性脊髓損傷的動(dòng)物模型中，調(diào)控細(xì)胞自噬可以減少創(chuàng)傷性脊髓損傷引起的脊髓相關(guān)細(xì)胞損傷，由此認(rèn)為，調(diào)控細(xì)胞自噬可以作為治療創(chuàng)傷性脊髓損傷的一

2、個(gè)治療靶點(diǎn)。二甲雙胍（Metformin，Met）是目前治療2型糖尿病中應(yīng)用最廣泛的降糖藥物之一。二甲雙胍降低高血糖的同時(shí)，并不會(huì)促進(jìn)內(nèi)源性胰島素的分泌，也少引起低血糖癥狀。除了有降血糖的作用之外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的許多疾病中都發(fā)現(xiàn)具有神經(jīng)保護(hù)作用，例如：缺血性腦損傷、帕金森病、亨廷頓病等等。我們研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷創(chuàng)傷性脊髓損傷后，自噬流的下游是被阻斷的。而二甲雙胍有助于促進(jìn)損傷脊髓自噬流的恢復(fù)，由此減少脊髓損傷大鼠的凋亡水平并促進(jìn)其運(yùn)動(dòng)功

3、能恢復(fù)，進(jìn)一步研究二甲雙胍的作用機(jī)制發(fā)現(xiàn)：AMPK參與二甲雙胍促進(jìn)脊髓損傷大鼠自噬功能的修復(fù)。
　　方法及結(jié)果：
　?、挪捎脢A閉方法來制作SD大鼠急性創(chuàng)傷性脊髓損傷動(dòng)物模型，即用脊髓夾閉器（30g）打擊脊髓T8~10段造成中度脊髓損傷模型。將雌性SD大鼠（220-250g）隨機(jī)分為假手術(shù)組、SCI組、SCI+Met組，分別在手術(shù)后1d，3d，7d，14d，21d，28d進(jìn)行大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)價(jià)，采用BBB行為學(xué)評(píng)分及斜板實(shí)驗(yàn)

4、對(duì)其后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)價(jià)。發(fā)現(xiàn)給予SCI+Met組在1d，3d，7d的BBB評(píng)分以及斜板實(shí)驗(yàn)的評(píng)分與 SCI組并無顯著差異，而在14d，21d，28d出現(xiàn)了明顯的差異，這說明Met能促進(jìn)脊髓損傷大鼠下肢運(yùn)動(dòng)功能的部分恢復(fù)。隨后在術(shù)后3d，7d，處死各組實(shí)驗(yàn)大鼠，收集損傷部位為中心長(zhǎng)約1cm脊髓節(jié)段作為組織標(biāo)本分別用石蠟包埋切片 H&E染色、Nissl染色、Western blot、TUNEL、掃描電鏡以及免疫熒光染色等檢測(cè)方法。從H&E

5、染色切片上觀察損傷后脊髓的組織結(jié)構(gòu)形態(tài)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI嚴(yán)重破壞了大鼠脊髓結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致大鼠脊髓局部出血、相關(guān)細(xì)胞壞死以及組織液化空洞形成，然而 SCI+Met組的損傷脊髓組織出血、核固縮等損傷均比 SCI組明顯減輕，同時(shí)還對(duì)損傷后脊髓的空洞面積進(jìn)行了量化計(jì)算，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SCI+Met組的空洞面積占脊髓總面積的比例比SCI組明顯減少，同時(shí)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)Nissl染色（神經(jīng)元細(xì)胞的特異性染色）發(fā)現(xiàn)，大鼠SCI后神經(jīng)元數(shù)量顯著減少，殘存運(yùn)動(dòng)

6、神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)尼氏小體的數(shù)量減少，顏色淡染。而SCI+Met組結(jié)果發(fā)現(xiàn)神經(jīng)元的數(shù)量較SCI組的顯著增多，同時(shí)殘存運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)尼氏小體的數(shù)量較多，顏色深染。為了從蛋白分子水平研究各實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓的凋亡水平，我們利用了Western blot技術(shù)對(duì)凋亡相關(guān)蛋白（cleaved Caspase3、Bax和Bcl-2）進(jìn)行了檢測(cè)，同時(shí)還對(duì)各組脊髓組織的切片進(jìn)行了TUNEL染色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)損傷后的大鼠脊髓的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平出現(xiàn)了明顯的提高，

7、同時(shí)TUNEL染色提示凋亡細(xì)胞的數(shù)量出現(xiàn)了明顯的升高，然而Met治療后的大鼠脊髓組織的凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平較未治療組有所下降，同時(shí)TUNEL染色證實(shí)其損傷周圍的脊髓組織的凋亡細(xì)胞的數(shù)量也出現(xiàn)了下降。由此證明，Met對(duì)SCI后大鼠的脊髓的組織結(jié)構(gòu)具有保護(hù)作用，同時(shí)還能抑制SCI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡的發(fā)生。⑵為了研究SCI后大鼠脊髓自噬水平的變化，我們利用掃描電子顯微鏡對(duì)各實(shí)驗(yàn)組的大鼠脊髓進(jìn)行了自噬囊泡的觀察，并利用Western blot技術(shù)

8、以及免疫熒光染色的技術(shù)對(duì)自噬相關(guān)蛋白進(jìn)行了分析。掃描電子顯微鏡的結(jié)果顯示， SCI后自噬囊泡的數(shù)量出現(xiàn)了明顯的增加，Western blot以及免疫熒光染色的結(jié)果提示自噬相關(guān)蛋白（LC3以及beclin-1）的水平出現(xiàn)升高。但是原本應(yīng)該下降的自噬底物蛋白（P62）以及可以被自噬所降解的泛素化蛋白（Ubiquitinated proteins，Ub）出現(xiàn)了異常的升高，同時(shí)Cathepsin D（CTSD）的結(jié)果也證明自噬溶酶體的降解功能被

9、抑制。以上矛盾的結(jié)果提示我們，SCI后脊髓組織的自噬是被阻斷掉的。然而給予Met治療后，我們發(fā)現(xiàn)，雖然自噬上游的相關(guān)指標(biāo)（自噬囊泡的數(shù)量以及LC、beclin-1的表達(dá)水平）并沒有出現(xiàn)顯著的差異，但是自噬的下游相關(guān)指標(biāo)（P62、Ub的表達(dá)水平）出現(xiàn)了顯著的下降，自噬溶酶體的功能（CTSD）也得到了恢復(fù)。結(jié)合以上研究結(jié)果，我們可以認(rèn)為SCI后大鼠脊髓的自噬水平出現(xiàn)了抑制，但是Met的治療可以一定程度上恢復(fù)SCI后的自噬紊亂。⑶為了研究Me

10、t在SCI中的神經(jīng)保護(hù)作用以及抗凋亡作用是否與自噬紊亂的修復(fù)有關(guān)，我們?cè)趧?dòng)物實(shí)驗(yàn)中，利用氯奎（Chloroquine，CQ）作為自噬流的抑制劑，與Met聯(lián)合使用拮抗Met的促自噬作用。通過BBB行為學(xué)評(píng)分、斜板實(shí)驗(yàn)、H&E染色、Nissl染色、Western blot等檢測(cè)手段對(duì)各組實(shí)驗(yàn)大鼠進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCI+Met+CQ組的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)情況和凋亡相關(guān)蛋白的水平與SCI組沒有顯著差異。結(jié)合以上結(jié)果，我們可以認(rèn)為，Met通過恢復(fù)

11、SCI后自噬流的紊亂，從而減少SCI后脊髓組織的結(jié)構(gòu)破壞以及細(xì)胞凋亡的發(fā)生。⑷在發(fā)現(xiàn) Met對(duì) SCI誘導(dǎo)的自噬紊亂有保護(hù)作用后，為了進(jìn)一步探索Met潛在的機(jī)制。結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，發(fā)現(xiàn)Met可以激活A(yù)MPK信號(hào)通路，同時(shí)AMPK能夠參與mTOR的調(diào)節(jié)，而mTOR又是自噬調(diào)控的關(guān)鍵蛋白，結(jié)合本課題實(shí)驗(yàn)，我們發(fā)現(xiàn)SCI后p- AMPK/AMPK表達(dá)上調(diào)和p- mTOR/mTOR表達(dá)下調(diào)，這一結(jié)果提示脊髓損傷后自噬的上游是激活的，但是對(duì)自噬的

12、激活程度相對(duì)薄弱，然而 Met治療可以進(jìn)一步激活自噬的上游。同時(shí)，我們?cè)诩?xì)胞實(shí)驗(yàn)中，還引入了AMPK抑制劑（Compound C）來進(jìn)一步證實(shí)Met是否通過激活A(yù)MPK從而抑制mTOR。結(jié)果顯示當(dāng)AMPK被Compound C抑制時(shí)，Met對(duì)自噬相關(guān)蛋白（mTOR以及P70S6K）的磷酸化水平的影響被明顯減弱。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，我們還利用免疫熒光染色技術(shù)，引入bafilmycin A1（Baf A1）在體外進(jìn)行了細(xì)胞自噬流的檢測(cè)。最終結(jié)果也