二甲雙胍對(duì)肺腺癌生長(zhǎng)的抑制作用及其機(jī)制研究.pdf

1、第一部分二甲雙胍對(duì)肺腺癌細(xì)胞體外增殖的作用研究 目的：研究二甲雙胍對(duì)體外培養(yǎng)的肺腺癌細(xì)胞株的增殖、細(xì)胞周期、凋亡等方面的作用，觀察二甲雙胍與順鉑聯(lián)合使用對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響。 方法：以0、0.5、2、8mmol/L四種濃度的二甲雙胍分別對(duì)肺腺癌細(xì)胞株A549和NCI-H1299進(jìn)行體外干預(yù)，在第0、24、48和72h，以MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖情況。將上述各濃度的二甲雙胍與順鉑(10ug/mL)聯(lián)用后，再次檢測(cè)藥物干預(yù)不同

2、時(shí)間后細(xì)胞的活性變化。選取A549細(xì)胞株為主要研究對(duì)象，以二甲雙胍干預(yù)48h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞在細(xì)胞周期及早期凋亡率等方面的差異。 結(jié)果：(1)與對(duì)照組相比，二甲雙胍2mmol/L組和8mmol/L組細(xì)胞的增殖活性在藥物作用24h后即明顯下降，以后者的下降更為明顯；0.5mmol/L組細(xì)胞在藥物作用48h后也呈顯著的生長(zhǎng)抑制。隨著干預(yù)時(shí)間延長(zhǎng)，二甲雙胍對(duì)各組細(xì)胞增殖的抑制更加顯著。(2)二甲雙胍與順鉑聯(lián)合使用時(shí)，對(duì)肺

3、腺癌細(xì)胞增殖的抑制作用較單用順鉑更強(qiáng)；二甲雙胍的濃度越高、對(duì)細(xì)胞干預(yù)的時(shí)間越長(zhǎng)，該抑制作用越明顯。(3)二甲雙胍干預(yù)A549細(xì)胞48h后，與對(duì)照組相比，0.5mmol/L組細(xì)胞的周期分布及早期凋亡率均無(wú)明顯變化；2mmol/L組G1期細(xì)胞所占比重顯著增高(P＜0.05)，而S期細(xì)胞比重顯著降低(P＜0.01)，細(xì)胞的早期凋亡率顯著增加(P＜0.05)：8mmol/L組G1期細(xì)胞所占比重顯著升高，S期和G2/M期細(xì)胞則相應(yīng)減少，細(xì)胞的早期

4、凋亡率也明顯增高(均P＜0.01)。 結(jié)論：二甲雙胍可以使細(xì)胞周期循環(huán)阻滯于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞的早期凋亡增加，從而有效抑制肺腺癌細(xì)胞株的體外增殖，其作用呈濃度及時(shí)間依賴(lài)性增強(qiáng)；二甲雙胍與順鉑共同作用可以增強(qiáng)對(duì)肺腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)的抑制作用。 第二部分 JNK/p38 MAPK-Caspase信號(hào)傳導(dǎo)通路在二甲雙胍誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡中的作用研究 目的：研究二甲雙胍對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)AMPK、JNK、p38 MAPK的磷酸化

5、蛋白及Caspase家族蛋白表達(dá)水平的影響，探討JNK/p38 MAPK-Caspase信號(hào)傳導(dǎo)通路在二甲雙胍誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：以5mmol/L的二甲雙胍對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行體外干預(yù)，在干預(yù)的第0、15、30和60min時(shí)，分別抽提細(xì)胞總蛋白，以Westernblot技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)AMPK、JNK、p38 MAPK的總蛋白和磷酸化蛋白的表達(dá)：在干預(yù)后第0、12、24和48h，檢測(cè)剪切后的Caspase-3、8、

6、9活性蛋白的表達(dá)水平。選擇特異性的JNK通路阻斷劑SP600125和p38 MAPK通路阻斷劑SB202190分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理1～2h，再進(jìn)行二甲雙胍(5mmol/L)干預(yù)，48h后，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞早期凋亡的情況。 結(jié)果：(1)二甲雙胍干預(yù)前后，A549細(xì)胞內(nèi)AMPK、JNK和p38 MAPK的總蛋白表達(dá)強(qiáng)度無(wú)顯著變化。二甲雙胍干預(yù)前，細(xì)胞內(nèi)上述蛋白的磷酸化蛋白及剪切后的Caspase-3、8、9的表達(dá)量極低；p-A

7、MPK、p-p38和p-JNK的表達(dá)水平在藥物干預(yù)15min后即明顯增強(qiáng)，至60min后明顯衰減，而相應(yīng)的總蛋白則變化不明顯；Caspase-8、9活性蛋白的表達(dá)水平在藥物干預(yù)12h后明顯增強(qiáng)，24h后，Caspase-3的表達(dá)也出現(xiàn)增強(qiáng)。(2)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果提示，SP600125和SB202190本身對(duì)A549細(xì)胞的凋亡無(wú)顯著影響；但使用這兩種抑制劑分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理后，再行二甲雙胍干預(yù)，細(xì)胞的早期凋亡率較單純二甲雙胍干預(yù)組顯著

8、降低(P＜0.05)。 結(jié)論：JNK/p38 MAPK-Caspase信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了對(duì)二甲雙胍誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞凋亡的調(diào)控。 第三部分 GADD153在二甲雙胍誘導(dǎo)肺腺癌細(xì)胞凋亡中的作用研究 目的：研究二甲雙胍對(duì)肺腺癌A549細(xì)胞內(nèi)GADD153基因表達(dá)的影響，探討GADD153基因在二甲雙胍誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞凋亡中的作用。 方法：以5mmol/L的二甲雙胍對(duì)A549細(xì)胞進(jìn)行體外干預(yù)，在第0、12、24、

9、48和72h，抽提細(xì)胞總RNA，采用Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)各時(shí)間點(diǎn)A549細(xì)胞內(nèi)GADD153 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。設(shè)計(jì)并合成GADD153靶向siRNA，將其轉(zhuǎn)染入A549細(xì)胞，通過(guò)RNA干擾特異性的抑制細(xì)胞內(nèi)GADD153基因及蛋白的表達(dá)。采用Realtime-PCR和Western blot技術(shù)驗(yàn)證對(duì)目的基因的干擾效率。以5mmol/L的二甲雙胍干預(yù)GADD153基因干擾后的A549細(xì)胞，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)藥物干預(yù)48

10、h后細(xì)胞的早期凋亡率。 結(jié)果：(1)二甲雙胍作用12h后，A549細(xì)胞內(nèi)的GADD153 mRNA表達(dá)水平即顯著增高(P＜0.01)；隨藥物干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，該基因的表達(dá)增高更加明顯，至72h升至最高，約為干預(yù)前的14.12倍。(2)GADD153 siRNA轉(zhuǎn)染可以有效地抑制A549細(xì)胞內(nèi)GADD153基因的表達(dá)，干擾效率達(dá)86％左右。(3)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，GADD153基因干擾對(duì)于A549細(xì)胞的早期凋亡無(wú)顯著影響；經(jīng)二

11、甲雙胍干預(yù)48h后，GADD153干擾的A549細(xì)胞的早期凋亡率與未干擾的細(xì)胞相比明顯降低(P＜0.05)。 結(jié)論：GADD153基因及蛋白的表達(dá)增高可促進(jìn)二甲雙胍誘導(dǎo)的肺腺癌細(xì)胞的凋亡。 第四部分二甲雙胍抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究 目的：通過(guò)構(gòu)建肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模型，研究二甲雙胍對(duì)于肺腺癌體內(nèi)生長(zhǎng)的影響及安全性，并探討二甲雙胍在臨床抗腫瘤治療方面的價(jià)值。 方法：將人肺腺癌細(xì)胞A549接

12、種至BALB/c-nu小鼠腋背部皮下，建立移植瘤動(dòng)物模型。待移植瘤長(zhǎng)至約100mm3左右時(shí)，選取瘤塊大小、形狀較均一的裸鼠，隨機(jī)分為3組，每組5只，以腹腔注射的方式給藥治療，每日1次，持續(xù)1個(gè)月。對(duì)照組給予PBS0.2ml/d；met40組給予二甲雙胍40mg/kg/d；met200組給予二甲雙胍200mg/kg/d。觀察藥物干預(yù)過(guò)程中裸鼠的一般情況，每4天稱(chēng)量動(dòng)物的體重，測(cè)量移植瘤的長(zhǎng)短徑，以計(jì)算腫塊大小。治療結(jié)束后，頸椎脫臼法處死荷

13、瘤鼠，剝離移植瘤及肺、心、腦、肝、腎等臟器，以HE染色觀察腫瘤及各器官的形態(tài)，判定腫瘤有無(wú)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；以免疫組化染色檢測(cè)各組移植瘤內(nèi)Ki-67的表達(dá)情況；以TUEL染色原位檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的凋亡情況。試驗(yàn)重復(fù)2次。 結(jié)果：(1)以A549細(xì)胞接種于裸鼠右側(cè)腋背部皮下，成功構(gòu)建了肺腺癌的裸鼠皮下移植瘤模型。在為期1個(gè)月的藥物干預(yù)過(guò)程中，各組裸鼠的一般狀態(tài)良好，無(wú)明顯異常表現(xiàn)，未見(jiàn)明顯藥物毒副反應(yīng)。(2)在藥物干預(yù)的不同時(shí)間測(cè)量移植瘤的大

14、小，均以對(duì)照組的腫瘤體積最大，met40組其次，met200組的腫瘤體積最小。藥物干預(yù)1個(gè)月后，兩個(gè)二甲雙胍治療組的移植瘤平均體積均顯著小于對(duì)照組(P＜0.01)；以對(duì)照組為參照，40mg/kg/d和200mg/kg/d劑量的二甲雙胍腹腔注射給藥對(duì)裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制率分別為19.81％±6.25％和40.70％±8.98％。(3)對(duì)移植瘤標(biāo)本行免疫組化染色結(jié)果顯示，met40和met200組腫瘤內(nèi)Ki-67抗原的陽(yáng)性表達(dá)率分別為38.

15、80％±10.41％和32.85％±10.14％，均顯著低于對(duì)照組(58.18％±12.83％)(P＜0.01)。(4)TUNEL染色結(jié)果顯示，對(duì)照組腫瘤內(nèi)僅可見(jiàn)散在的凋亡細(xì)胞(3.1±1.8個(gè)/HPF)，而met40組和met200組腫瘤內(nèi)的凋亡細(xì)胞數(shù)量顯著增加(分別為13.6±3.41個(gè)/HPF和16.35±3.07個(gè)/HPF)(P＜0.01)，以后者增加更為明顯。 結(jié)論：40mg/kg/d和200mg/kg/d兩種濃度的二

16、甲雙胍均可有效的抑制肺腺癌裸鼠皮下移植瘤的生長(zhǎng)速度，使腫瘤細(xì)胞的凋亡增多、增殖活性減弱，且不會(huì)引起明顯的毒副反應(yīng)，提示二甲雙胍對(duì)于肺腺癌患者的治療具有較好的臨床應(yīng)用前景。 通過(guò)上述研究，得到結(jié)論如下： 1、二甲雙胍可以通過(guò)阻滯細(xì)胞周期于G1期，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，從而抑制肺腺癌細(xì)胞的體外增殖；二甲雙胍與順鉑聯(lián)用可增強(qiáng)對(duì)肺腺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制作用。 2、JNK/p38 MAPK--Caspase信號(hào)傳導(dǎo)通路參與了對(duì)二甲雙