澳洲茄邊堿聯(lián)合二甲雙胍抑制激素非依賴前列腺癌細(xì)胞生長的機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　前列腺癌是歐美國家常見的男性腫瘤，死亡率僅次于肺癌，近年來由于西化生活方式的影響，前列腺癌的發(fā)病率在亞洲國家呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，且發(fā)現(xiàn)時(shí)大多處于晚期，內(nèi)分泌治療為患者提供了一定的生存期，但是僅能提供大約20個(gè)月的無進(jìn)展生存期，后期逐漸發(fā)展為去勢(shì)抵抗前列腺癌(Castration resistant prostate cancer，CRPC)，主要表現(xiàn)為癌細(xì)胞在緩解期后又開始增殖，PSA持續(xù)性增高，極易發(fā)生骨轉(zhuǎn)移，許多患

2、者最終死于腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。前列腺癌由激素依賴向激素非依賴的轉(zhuǎn)變機(jī)制目前尚不明確，但隨著研究的進(jìn)展已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多條與激素非依賴轉(zhuǎn)變相關(guān)的信號(hào)通路，如在激素非依賴階段血PSA持續(xù)性增高，提示了雄激素受體(Androgen receptor，AR)信號(hào)通路并未被阻斷，其在去勢(shì)抵抗性前列腺癌(Castration resistant prostatecancer，CRPC)發(fā)生發(fā)展中持續(xù)發(fā)揮作用。其機(jī)制主要包括雄激素受體基因的突變、擴(kuò)增、AR信號(hào)

3、通路傳導(dǎo)異常等，以及近年來的研究熱點(diǎn)腫瘤干細(xì)胞，這類細(xì)胞具有強(qiáng)大的自我更新、多向分化和高度耐藥及轉(zhuǎn)移潛能，被認(rèn)為是腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的根源，且已有研究證明前列腺癌干細(xì)胞與PCa的耐藥具有相關(guān)性。但更重要的是前列腺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多步驟多因素的過程，涉及到細(xì)胞內(nèi)的一系列復(fù)雜的變化。因此研發(fā)相對(duì)低毒高效的腫瘤靶向藥物，探索能夠特異性協(xié)同抑制前列腺細(xì)胞的藥物組合并揭示其協(xié)同作用機(jī)制成為臨床上亟待解決的問題，具有重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

4、　　MUC1是單通道Ⅰ型跨膜蛋白，擁有重度糖基化的胞外區(qū)域，從細(xì)胞表面延伸200-500 nm,正常多分布在腺上皮或者腔管上皮細(xì)胞，如乳腺、食道、胃、十二指腸、胰腺、子宮、前列腺和肺，小部分分布在造血細(xì)胞，皮膚和間充質(zhì)細(xì)胞沒有MUC1的表達(dá)。在正常組織中，細(xì)胞表面MUC1帶負(fù)電荷的糖鏈形成物理屏障并能發(fā)揮粘附和抗粘附雙重作用以減輕免疫應(yīng)答，且糖鏈可寡聚化形成黏液膠潤滑基底上皮細(xì)胞，防止因PH值改變、污染物污染和微生物侵襲造成的傷害，除了

5、正常的生理作用以外，在許多類型的癌癥，如乳腺癌、結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、胰腺癌中，異常糖基化的MUC1常呈現(xiàn)過表達(dá)的趨勢(shì)，因此被作為一種致瘤因子受到廣泛的關(guān)注。研究表明MUC1可以調(diào)節(jié)結(jié)締組織生長因子、血小板源性生長因子A和血小板源性生長因子B并激活MAPK和PI3K/Akt信號(hào)通路，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和生存。異常的糖代謝是癌癥的一個(gè)重要特征，用來維持腫瘤細(xì)胞旺盛的新陳代謝，HIF-1α可以調(diào)節(jié)糖酵解過程中關(guān)鍵酶的表達(dá)，MUC1作為調(diào)節(jié)

6、器又可以調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)、穩(wěn)定性和活性，并與HIF-1α形成復(fù)合物結(jié)合到糖酵解相關(guān)基因啟動(dòng)子上促進(jìn)基因的表達(dá)和轉(zhuǎn)錄。此外MUC1還可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。侵襲作為腫瘤轉(zhuǎn)移的前提和先決條件，它使細(xì)胞從基底膜分離，降解周圍基質(zhì)最終侵犯周圍組織或進(jìn)入血液。在對(duì)前列腺癌的研究中發(fā)現(xiàn)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞DU145和PC3細(xì)胞相對(duì)于正常的前列腺上皮細(xì)胞PrEC MUC1表達(dá)明顯增多，而激素依賴前列腺癌細(xì)胞LNCaP MUC1表達(dá)缺失，

7、在前列腺癌細(xì)胞中MUC1-C（MUC1 C端亞基）亦能抑制AR受體的表達(dá)，使其轉(zhuǎn)變?yōu)楦哂星忠u力的雄激素非依賴表型并依賴MUC1-C生存，因此本課題我們將MUC1作為關(guān)鍵的目的蛋白進(jìn)行研究，探討前列腺癌由激素依賴向激素非依賴轉(zhuǎn)變的機(jī)制及前列腺癌激素非依賴階段的治療。
　　我國中藥資源豐富，且藥理作用廣泛，毒副作用小，越來越多的中藥被證明其活性成分具有抗腫瘤作用，并被廣泛應(yīng)用于臨床。因此，以MUC1為作用靶點(diǎn)，為前列腺癌激素非依賴階

8、段尋找新的抗腫瘤成分，具有一定的社會(huì)意義。
　　澳洲茄邊堿(solamargine，SM)是中藥龍葵主要活性成分之一，是一種天然甾體生物堿糖苷化合物和細(xì)胞毒性劑，能引起腫瘤細(xì)胞的凋亡或與其他化學(xué)藥物起到協(xié)同作用，增強(qiáng)治療效果，有研究表明澳洲茄邊堿能增強(qiáng)肺癌細(xì)胞對(duì)TNFs的敏感性，課題組前期研究也表明澳洲茄邊堿能通過stat3信號(hào)通路抑制肺癌細(xì)胞生長并引起肺癌細(xì)胞凋亡，但澳洲茄邊堿對(duì)于去勢(shì)抵抗性前列腺癌的作用未見報(bào)道。研究發(fā)現(xiàn)SM可

9、以激活A(yù)MPKα，且流行病學(xué)研究表明，AMPKα的激動(dòng)劑二甲雙胍可以降低乳腺癌，結(jié)腸癌、胰腺癌、和肝癌癥的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，甚至可能改善癌癥的預(yù)后。結(jié)合國內(nèi)外研究，我們初步推斷二甲雙胍和SM可能具有一定的疊加作用。
　　本研究采用激素非依賴前列腺癌細(xì)胞株DU145和PC3為體外模型，探討澳洲茄邊堿聯(lián)合二甲雙胍對(duì)激素非依賴前列腺癌細(xì)胞生長的抑制作用及其可能的分子機(jī)制，并用裸鼠建立體外移植瘤模型，驗(yàn)證澳洲茄邊堿的體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　方

10、法：
　　1.MTT檢測(cè)SM抑制DU145和PC3細(xì)胞活力的效應(yīng)和時(shí)間劑量關(guān)系，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SM對(duì)PC3細(xì)胞周期的影響，western-blot、RT-PCR和啟動(dòng)子活性檢測(cè)與此有關(guān)信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白的變化，并使用相關(guān)激酶抑制劑和過表達(dá)質(zhì)粒以改變關(guān)鍵蛋白的活化狀態(tài)，觀察上下游信號(hào)和細(xì)胞生長抑制效應(yīng)的改變。明確相關(guān)信號(hào)通路與SM引起的增殖抑制效應(yīng)的關(guān)系，明確其分子機(jī)制。
　　2、設(shè)立空白對(duì)照組，劑量依次增加的SM組，作用DU1

11、45和PC3細(xì)胞，MTT和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)SM對(duì)細(xì)胞生長和細(xì)胞周期的影響以及是否具有時(shí)間和劑量關(guān)系，western-blot、RT-PCR等檢測(cè)相關(guān)通路蛋白的表達(dá)變化，并干預(yù)其活化狀態(tài)，明確SM發(fā)揮作用的信號(hào)通路。
　　3、SM聯(lián)合Metformin，分為空白對(duì)照組、SM組、metformin組和SM+metformin組，MTT檢測(cè)Metformin是否能增強(qiáng)SM抑制細(xì)胞增殖的效應(yīng)，western-blot、RT-PCR等檢測(cè)Me

12、tformin是否能增強(qiáng)SM對(duì)相關(guān)通路蛋白的影響。
　　4、建立裸鼠荷瘤模型，通過皮下注射的方法，分別設(shè)立空白對(duì)照組，SM低劑量組(5 mg/kg)和SM高劑量組(10 mg/kg)，對(duì)照組注射等量PBS，觀察各組腫瘤的大小和重量差異以及有無轉(zhuǎn)移瘤等，明確SM體內(nèi)抗腫瘤活性。
　　結(jié)果：
　　1.SM能抑制DU145和PC3細(xì)胞生長，并能將PC3細(xì)胞阻滯在G0/G1期:6μmol/LSM作用24 h后DU145和PC3

13、細(xì)胞活力分別下降為(49.20±4.66)％、(56.28±2.36)％并具有時(shí)間和劑量依賴（P＜0.05），10μmol/LSM作用24 h后細(xì)胞活力分別為(25.71±2.56)％、(32.07±2.53)％，（P＜0.05）。流式細(xì)胞術(shù)顯示不同濃度SM(0、4、6、8μ mol/L)處理PC3細(xì)胞能引起PC3細(xì)胞阻滯在G1期，G1期細(xì)胞比例分別為(52.61±0.50)％、(52.96±1.49)％、(66.16±2.84)％和(

14、69.03±2.38)％，后兩者具與對(duì)照組比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　2.SM能激活A(yù)MPKα/NF-κ B/MUC1信號(hào)通路:不同濃度SM(0、1、2、4、6、8μ mol/L)處理DU145和PC3細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蛋白MUC1表達(dá)下調(diào)，轉(zhuǎn)錄因子p65亦下調(diào)，且過表達(dá)MUC1可以促進(jìn)細(xì)胞的增殖，在基因水平上SM能下調(diào)MUC1mRNA的表達(dá)和啟動(dòng)子的活性，在對(duì)其上游信號(hào)通路的研究中發(fā)現(xiàn)其能激活A(yù)MPKα，且AMPKα抑

15、制劑Compound C能逆轉(zhuǎn)由SM引起的MUC1及p65下調(diào)。
　　3.二甲雙胍可以增強(qiáng)SM的生物效應(yīng):二甲雙胍聯(lián)合SM相比單獨(dú)SM處理組，p65、MUC1下調(diào)更明顯，且AMPKα的磷酸化水平亦比單獨(dú)SM處理組明顯升高。
　　4.SM能抑制體內(nèi)腫瘤的生長:體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明SM腹腔注射能有效抑制體內(nèi)腫瘤的生長，高劑量組與對(duì)照組相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)果說明SM在體內(nèi)具有抗腫瘤活性。
　　結(jié)論:
　　

16、1.澳洲茄邊堿可以抑制前列腺癌激素非依賴細(xì)胞DU145和PC3的生長并可引起PC3細(xì)胞周期阻滯。
　　2.澳洲茄邊堿可以通過激活A(yù)MPKα抑制下游NF-κ B/MUC1信號(hào)通路，從而抑制細(xì)胞細(xì)胞生長。
　　3.澳洲茄邊堿聯(lián)合二甲雙胍在抑制前列腺癌激素非依賴細(xì)胞生長過程中具有疊加效應(yīng)。
　　4.澳洲茄邊堿可以抑制裸鼠體外移植瘤的生長，作用機(jī)制與AMPKα的激活并抑制下游NF-κ B/MUC1信號(hào)通路有關(guān)。
　　綜上