二甲雙胍上調(diào)βKlotho抑制雄激素相關(guān)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化.pdf

1、研究背景：
　　世界范圍內(nèi)，前列腺癌在男性所有惡性腫瘤中發(fā)病率位居第二，在美國的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害男性健康的腫瘤，在我國其發(fā)病率也呈逐年上升的趨勢。早期患者可通過根治性手術(shù)或者根治性放療治愈。對于晚期前列腺癌，雄激素剝奪(androgen deprivation therapy, ADT)仍然是主要的治療方法。雖然初始治療階段ADT能有效抑制腫瘤生長，但是在2-3年內(nèi)超過一半的患者會發(fā)展到耐藥階段，也就是我們通常所

2、知的去勢抵抗性前列腺癌(castration-resistantprostate cancer，CRPC)，并且其中位生存期僅為12～18個(gè)月。雄激素受體(androgen receptor，AR)信號通路的持續(xù)激活仍然是CRPC發(fā)生、進(jìn)展的關(guān)鍵因素。
　　近年來有研究表明，上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchymal transition，EMT)和AR信號通路存在著廣泛的串話，在前列腺癌發(fā)生以及進(jìn)展為CRP

3、C的過程中發(fā)揮著重要作用。雖然EMT和AR信號通路之間有著密切的聯(lián)系，但具體到調(diào)控機(jī)制，不同的研究者得出了不同甚至是矛盾的結(jié)論，仍需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證。除AR信號通路外，其它一些信號通路也參與到前列腺癌EMT過程中，包括:RTK、Pten、STAT3、Wnt和Notch-hedgehog等。通過干擾上述信號通路，靶向逆轉(zhuǎn)EMT可能為以后前列腺癌的治療提供新的思路。
　　成纖維細(xì)胞生長因子（fibroblast growth f

4、actor, FGF）及其受體FGFR普遍存在于正常細(xì)胞中，共同構(gòu)成FGF信號通路，在細(xì)胞生長、分化、遷移、血管生成以及組織創(chuàng)傷修復(fù)中起重要作用。近年研究表明，該通路在前列腺癌的發(fā)生、發(fā)展中同樣發(fā)揮重要作用。其作用機(jī)制主要是通過激活一系列下游信號通路實(shí)現(xiàn)，包括Ras-Raf-Mapk、PI3k-Akt、Stats和PLCγ等。大部分FGFs是通過自分泌或者旁分泌的方式發(fā)揮生理作用。FGF19亞科是FGFs家族中特殊的一類，包括FGF19

5、、FGF21、FGF23，它們可通過類似激素的內(nèi)分泌功能入血從而調(diào)節(jié)許多生理功能，包括能量和膽汁酸的代謝，糖脂的代謝，以及維持磷、維生素D的動態(tài)平衡。有學(xué)者先后報(bào)道了FGF19、FGF23能夠促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。另有研究提示FGFR1的活化可以導(dǎo)致不可逆的前列腺腺癌和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展。盡管大量研究把FGF/FGFR信號通路的激活和腫瘤的進(jìn)展聯(lián)系起來，但是在一些特定的條件下，此通路的激活可以表現(xiàn)出抑制腫瘤的作用。此外，一系

6、列的FGFs和FGFRs抑制劑已經(jīng)應(yīng)用在了前列腺癌的基礎(chǔ)和臨床試驗(yàn)中，展現(xiàn)出其廣闊的應(yīng)用前景。
　　FGF/FGFR信號通路的激活需要一個(gè)關(guān)鍵分子:βklotho(KLB)。βklotho作為FGF19、FGF21的共受體，可以提高FGF19、FGF21與FGFRs（特別是FGFR1和FGFR4）的親和性，形成βklotho-FGF19/FGF21-FGFR4復(fù)合體，發(fā)揮調(diào)節(jié)血糖、膽汁酸、能量代謝的生理作用。βklotho目前在腫

7、瘤中的研究較少，并且其到底是發(fā)揮促癌還是抑癌作用仍存在爭議。雖然FGF19/FGFR4信號通路能夠促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展，但是作為FGF19/FGFR4共受體，βklotho在前列腺癌的表達(dá)以及βklotho與前列腺生物學(xué)行為的關(guān)系還未有報(bào)道。
　　二甲雙胍是世界范圍內(nèi)治療2型糖尿病應(yīng)用最廣泛的藥物。流行病學(xué)研究表明，二甲雙胍可以降低多種腫瘤的發(fā)病率和疾病進(jìn)展率。目前已有大量體內(nèi)、體外研究表明二甲雙胍具有廣泛的抗腫瘤作用，主要和激活A(yù)

8、MPK(AMP-activatedprotein kinase)通路和增加胰島素敏感性有關(guān)。有研究表明AMPK和AR之間存在負(fù)反饋調(diào)節(jié)，二甲雙胍可下調(diào)AR表達(dá)，抑制前列腺癌的生長。除此之外，二甲雙胍在多種腫瘤（包括前列腺癌）的研究中表現(xiàn)出了抗EMT的作用。雖然目前已有大量的二甲雙胍抑制腫瘤發(fā)生、進(jìn)展的研究，但是近年的研究熱度仍然不減，二甲雙胍抗腫瘤的新機(jī)制層出不窮。研究表明βKlotho與FGF19-FGFRs形成復(fù)合體，具有和二甲雙胍

9、類似的降血糖作用，二甲雙胍和βKlotho之間是否具有潛在聯(lián)系，目前還未見報(bào)道。
　　第一部分:βKlotho抑制雄激素相關(guān)的前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　目的：
　　首先研究雄激素/雄激素受體信號通路與前列腺癌EMT的關(guān)系，檢測βklotho的表達(dá)水平與前列腺癌患者臨床參數(shù)以及預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)而在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中探討βklotho與前列腺癌EMT的關(guān)系，從而發(fā)現(xiàn)逆轉(zhuǎn)EMT的潛在靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.采用W

10、estern Blot檢測雙氫睪酮(dihydrotestosterone，DHT)對于AR陰性細(xì)胞系PC3和AR陽性細(xì)胞系LNCaP EMT的影響。
　　2.采用Western Blot檢測βKlotho在不同前列腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)，免疫組織化學(xué)檢測βKlotho在前列腺增生和前列腺癌組織中的表達(dá)。The Human ProteinAltas數(shù)據(jù)庫分析βKlotho在正常前列腺組織和前列腺癌中的表達(dá)。
　　3.采用卡方檢驗(yàn)

11、檢測βKlotho表達(dá)水平與前列腺癌患者年齡、腫瘤分期、分級的相關(guān)性;通過Kaplan-Meier單因素生存分析法檢測腫瘤分期、分級、βKlotho表達(dá)水平與生存預(yù)后的關(guān)系。
　　4.采用CCK-8、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測βKlotho對于前列腺癌細(xì)胞系增殖的影響;采用Transwell、細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測βKlotho對于細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響;通過流式細(xì)胞儀檢測Annexin V-PE/7-AAD染色情況評估細(xì)胞的早期凋亡。

12、　　5.采用Western Blot、細(xì)胞免疫熒光法檢測過表達(dá)和敲減βKlotho對前列腺癌細(xì)胞EMT的影響。
　　6.裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)檢測βKlotho對于前列腺腫瘤生長的影響，免疫組織化學(xué)檢測βKlotho對于裸鼠前列腺癌EMT的影響。
　　結(jié)果：
　　1.DHT能夠顯著下調(diào)AR陰性的PC3細(xì)胞上皮標(biāo)記物E-cadherin的表達(dá)(p＜0.01)，上調(diào)間質(zhì)標(biāo)記物N-caderin(p＜0.05)、vimentin(p＜

13、0.05)的表達(dá)，上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子slug、snail(p＜0.05)的表達(dá)。DHT能夠激活ERK1/2，MAPK/ERK1/2抑制劑U0126能夠反轉(zhuǎn)DHT所致的上述EMT標(biāo)記物的變化。在AR陽性的LNCaP細(xì)胞中，DHT刺激對EMT指標(biāo)無明顯作用。
　　2.βKlotho在PC3、LNCaP、C4-2B三種細(xì)胞中均有表達(dá)，以LNCaP中的表達(dá)量最高，其表達(dá)量是PC3的2.24倍(p＜0.01)，是C4-2B的1.67倍(p＜0.0

14、1)。30例前列腺增生βKlotho的染色得分:10.15土0.29，30例前列腺癌βKlotho的染色得分:7.47±0.41，兩者的差異表達(dá)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.05)，高級別（Gleason評分≥7分）患者比低級別（Gleason評分≤6）患者的βKlotho表達(dá)量更低。通過對The Human Protein Altas數(shù)據(jù)庫分析，發(fā)現(xiàn)前列腺癌中的βKlotho較正常前列腺組織的表達(dá)降低，與我們的研究結(jié)果一致。
　　3.

15、卡方檢驗(yàn)表明βKlotho的低表達(dá)與前列腺癌的高分級有關(guān)(p＜0.05)。βKlotho表達(dá)水平與患者的年齡、臨床分期無關(guān)(p＞0.05)。Kaplan-Meier生存分析法，log-rank檢驗(yàn)表明βKlotho低表達(dá)患者生存率明顯低于βKlotho中等表達(dá)和高表達(dá)患者。腫瘤高分期比低分期預(yù)后差，高分級與低分級之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　4.PC3細(xì)胞中過表達(dá)βKlotho顯著降低細(xì)胞的增殖能力，增加細(xì)胞的早期凋亡，抑制細(xì)胞的遷移、

16、侵襲能力。LNCaP細(xì)胞中敲減βKlotho能夠促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞早期凋亡，促進(jìn)細(xì)胞的遷移與侵襲能力。
　　5.在PC3細(xì)胞中過表達(dá)βKlotho后能顯著上調(diào)DHT所誘導(dǎo)的E-cadherin的降低作用(p＜0.05)，下調(diào)DHT所誘導(dǎo)的N-cadherin、vimentin、slug、snail的升高作用，這種效應(yīng)在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí);LNCaP細(xì)胞敲減βKlotho后E-cadherin表達(dá)降低，N-cadheri

17、n、vimentin的表達(dá)升高，這種效應(yīng)在細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)中得到證實(shí)。
　　6.裸鼠成瘤4周后，對照組的腫瘤體積為2436±790(mm3)，βKlotho過表達(dá)組腫瘤體積為1590±504(mm3)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p＜0.01)。βKlotho的過表達(dá)明顯抑制PC3細(xì)胞的皮下移植瘤的生長。免疫組織化學(xué)表明，βKlotho過表達(dá)的裸鼠移植瘤中E-cadherin的表達(dá)增高了2.68倍(p＜0.01)，N-cadherin的表

18、達(dá)降低了69.7％(p＜0.01)，snail的表達(dá)降低了46.1％(p＜0.01)。
　　結(jié)論：
　　1.雄激素對前列腺癌EMT的影響是AR依賴性途徑和AR非依賴性途徑綜合作用的結(jié)果。
　　2.前列腺癌細(xì)胞系、前列腺癌組織中均存在βKlotho的表達(dá)，前列腺癌βKlotho表達(dá)較前列腺增生組織降低，βKlotho的低表達(dá)與前列腺癌的高分級有關(guān)，βKlotho的表達(dá)降低是前列腺癌患者生存的不利因素。
　　3.βK

19、lothot通過抑制ERK1/2信號通路抑制雄激素/雄激素受體相關(guān)的EMT，在體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)揮抗前列腺癌作用。
　　4.βKlotho作為EMT的抑制因子，可作為晚期前列腺癌治療的一個(gè)新的潛在靶點(diǎn)。
　　第二部分:二甲雙胍上調(diào)βKlotho抑制前列腺癌上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化
　　目的：
　　首先研究二甲雙胍與前列腺癌EMT、與前列腺癌AR信號通路之間的關(guān)系。鑒于二甲雙胍與βKlotho均有降低血糖的作用，進(jìn)一步研究兩者

20、潛在的關(guān)系，并對其機(jī)制作初步探究。
　　方法：
　　1.采用克隆形成實(shí)驗(yàn)、CCK8檢測二甲雙胍對于PC3、LNCaP細(xì)胞增殖的影響。
　　2.采用Western Blot檢測二甲雙胍對βKlotho，對EMT的影響。
　　3.采用組織塊培養(yǎng)方法檢測二甲雙胍對EMT的影響。
　　4.采用RT-PCR檢測二甲雙胍對于AR轉(zhuǎn)錄活性的影響。
　　5.采用細(xì)胞免疫熒光方法檢測二甲雙胍對于AR細(xì)胞分布的影響。

21、r>　　6.GEO數(shù)據(jù)庫分析AR蛋白與βKlotho DNA潛在聯(lián)系。
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍抑制PC3、LNCaP細(xì)胞增殖，具有濃度和時(shí)間依賴性。
　　2.在PC3細(xì)胞中，二甲雙胍能明顯激活A(yù)MPK信號通路，降低AR的表達(dá)，上調(diào)E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)N-cadherin的表達(dá)，這種效應(yīng)在組織塊培養(yǎng)中得到證實(shí)。有趣的是，二甲雙胍能夠明顯上調(diào)βKlotho的表達(dá)，具有濃度依賴性。在PC3細(xì)胞中敲減βKlo

22、tho后，二甲雙胍所致的E-cadherin的上調(diào)，N-cadherin的下調(diào)被逆轉(zhuǎn)。
　　3.二甲雙胍能夠抑制DHT所致的LNCaP細(xì)胞AR轉(zhuǎn)錄的激活，包括AR以及下游PSA、NKX3.1 mRNA水平的降低。并且，二甲雙胍能夠抑制AR從細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的轉(zhuǎn)運(yùn)。
　　4.GEO數(shù)據(jù)庫分析提示AR蛋白與βKlotho DNA在外顯子1和外顯子2之間存在結(jié)合位點(diǎn)，DHT能夠促進(jìn)AR蛋白與βKlotho DNA的結(jié)合，而抗雄藥物恩