二甲雙胍對(duì)上皮性卵巢癌化療耐藥的抑制作用研究.pdf

1、目的:
　　二甲雙胍常用于治療2型糖尿病，近年來(lái)發(fā)現(xiàn)二甲雙胍有抑制惡性腫瘤生長(zhǎng)的作用并且增強(qiáng)化療藥物的療效。在婦科惡性腫瘤中，致死率最高的為卵巢癌，對(duì)于此疾病的預(yù)后而言，關(guān)鍵點(diǎn)在于摸索出預(yù)防以及逆轉(zhuǎn)耐藥的有效對(duì)策。有研究表明惡性腫瘤的形成和發(fā)展與IGF-1R密不可分，胰島素樣生長(zhǎng)因子系統(tǒng)（IGF-I、IGF-1R和AKT）與卵巢癌耐藥有關(guān)。因此我們實(shí)驗(yàn)?zāi)康耐ㄟ^(guò)研究二甲雙胍對(duì)耐藥卵巢癌細(xì)胞中IGF系統(tǒng)的作用來(lái)探討二甲雙胍對(duì)上皮性卵巢

2、癌化療的耐藥機(jī)制，找尋一種新的卵巢癌的輔助治療方法。
　　方法:
　　(1)采用原位雜交技術(shù)、免疫組化和免疫熒光技術(shù)檢測(cè)上皮性卵巢癌組織、良性腫瘤組織，正常卵巢組織中MRP2蛋白和mRNA表達(dá)，分析其與卵巢癌生物學(xué)特征之間的關(guān)系;
　　(2)CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)，計(jì)算耐藥卵巢癌細(xì)胞鉑類(lèi)的耐藥指數(shù);
　　(3)流式細(xì)胞儀、AnnexinV/PI雙染法檢測(cè)CP70細(xì)胞周期及凋亡;
　　(4

3、)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)不同濃度二甲雙胍作用CP70細(xì)胞后MRP2及相關(guān)信號(hào)通路IGF信號(hào)通路中IGF-1，IGF-1R，AKT蛋白的表達(dá)水平變化;
　　(5)熒光定量PCR法檢測(cè)不同濃度二甲雙胍作用CP70細(xì)胞后，MRP2及IGF-1，IGF-1R，AKT，p-IGF1，p-IGF1R，p-AKT基因表達(dá)的變化;
　　(6)建立順鉑耐藥人卵巢癌CP70細(xì)胞株和不耐藥A2780細(xì)胞株皮下移植瘤模型分析二甲雙胍對(duì)裸鼠移植瘤組織中MR

4、P2表達(dá)的影響及其對(duì)腫瘤的抑制。
　　結(jié)果:
　　(1)MRP2蛋白表達(dá)在正常卵巢組織、良性卵巢組織和上皮性卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0(0/5)，20％(2/10)和58％(14/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05;MRP2基因表達(dá)在正常卵巢組織、良性卵巢組織以及上皮性卵巢癌中的陽(yáng)性表達(dá)率分別為0(0/5)，10％(1/10)和48％(12/25)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.05。卵巢上皮癌組織中MRP2蛋白以及MRP

5、2mRNA的表達(dá)不受病人年齡、病理分期影響，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05），但其表達(dá)與病理類(lèi)型、有無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)。
　　(2)用不同濃度的二甲雙胍作用于卵巢癌細(xì)胞株A2780和耐藥細(xì)胞株CP70后，對(duì)順鉑的敏感性增加。CCK-8法檢測(cè)二甲雙胍處理CP70細(xì)胞24h后，對(duì)順鉑的耐藥倍數(shù)明顯下降，且呈濃度依賴(lài)性。
　　(3)CP70細(xì)胞周期分布隨著二甲雙胍濃度升高而發(fā)生明顯改變，表現(xiàn)為G0/G1期比例增多，1

6、0mM/ml與0.01mM/ml組相比差異有顯著性(F=69.514，P＜0.05)，100mmol/L二甲雙胍濃度的自然凋亡率與10mmol/L濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=79.814，P＜0.05）。
　　(4)蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)二甲雙胍處理CP70細(xì)胞48h后，發(fā)現(xiàn)IGF-1，IGF-1R，AKT的表達(dá)都隨著二甲雙胍濃度的增加呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)，p-IGF1，P-IGF1R，P-AKT降低趨勢(shì)相比較于IGF-1，IGF-1R

7、，AKT更明顯，二者都有明顯的濃度依賴(lài)性。各蛋白組與β-actin相對(duì)灰度比與0mM/ml濃度二甲雙胍比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，其中0mM/ml二甲雙胍+阻斷劑LY294002組10mM/ml聯(lián)合應(yīng)用對(duì)卵巢癌細(xì)胞CP70細(xì)胞的抑制作用最顯著。
　　(5)二甲雙胍可以影響MRP2及IGF-1，IGF-1R，AKT，p-IGF1，p-IGF1R，p-AKT基因的表達(dá)，并呈濃度依賴(lài)性，從而抑制CP70細(xì)胞的增殖活性，不同濃

8、度的二甲雙胍組與正常對(duì)照組表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(6)觀(guān)察A2780組和CP70組裸鼠的腫瘤體積與生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，順鉑組+二甲雙胍組的腫瘤體積明顯小于對(duì)照組和單純使用順鉑治療組，A2780+順鉑+二甲雙胍的抑瘤率為59.16％，CP70+順鉑+二甲雙胍的抑瘤率則為79.03％，均明顯高于單純使用順鉑，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　(7)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證明二甲雙胍抑制MRP2蛋白的表達(dá)，且順鉑+二甲雙胍

9、兩種藥物聯(lián)合使用較單獨(dú)使用對(duì)A2780、CP70細(xì)胞具有更高的抑制率，兩藥表現(xiàn)出協(xié)同作用。
　　結(jié)論:
　　(1)MRP2蛋白在上皮性卵巢癌中有陽(yáng)性表達(dá)，表達(dá)水平與卵巢癌類(lèi)型和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　(2)一定濃度的二甲雙胍可以增強(qiáng)順鉑對(duì)卵巢癌CP70細(xì)胞的敏感性。
　　(3)二甲雙胍通過(guò)抑制IGF信號(hào)通路IGF-1、IGF-1R和AKT受體的表達(dá)抑制MRP2蛋白抑制卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。
　　(4)體內(nèi)