p53、線粒體基因多態(tài)性與二甲雙胍輔助卵巢癌化療增敏關(guān)系研究.pdf

1、本文主要從以下幾方面展開(kāi)論述：
　　第一部分：p53、線粒體DNA多態(tài)性與卵巢癌的關(guān)系。
　　目的：
　　通過(guò)對(duì)醫(yī)院臨床資料完整明確的河南地區(qū)非癌患者卵巢組織和上皮性卵巢癌病人癌變的卵巢組織中p53、D-loopDNA的突變和多態(tài)性進(jìn)行比較，依據(jù)測(cè)序結(jié)果結(jié)合臨床上繼發(fā)耐藥情況，研究河南地區(qū)人群中p53、D-loop的多態(tài)性、突變和上皮性卵巢癌發(fā)生、耐藥的關(guān)系，獲得潛在的上皮性卵巢癌檢測(cè)指標(biāo)和易耐藥檢測(cè)指標(biāo)。通過(guò)對(duì)病患外

2、周血、傳代細(xì)胞、卵巢組織及切片中p53、線粒體基因差異研究，探討外周血中游離DNA檢測(cè)卵巢癌及評(píng)估耐藥性的可能，并對(duì)組織切片與實(shí)際新鮮組織多態(tài)性的差異比較，為臨床和后續(xù)試驗(yàn)提供依據(jù)和借鑒。
　　方法：
　　1.卵巢組織切片中p53、線粒體基因的差異研究
　　選取鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院（以下簡(jiǎn)稱“鄭大一附院”）和濮陽(yáng)市人民醫(yī)院收治的在河南生活超過(guò)二十年的病患卵巢組織切片作為研究對(duì)象。其中60份上皮性卵巢癌組織石蠟標(biāo)本為首次

3、腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)中收集到的，對(duì)照組61例卵巢癌陰性標(biāo)本為非癌患者卵巢癌組織切片。
　　2.外周血、傳代細(xì)胞、卵巢組織及切片中p53、線粒體基因差異研究
　　結(jié)果：
　　1.卵巢組織切片中p53、線粒體基因的差異
　　對(duì)121份臨床卵巢組織切片進(jìn)行DNA提取，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)合熔解曲線來(lái)優(yōu)化并監(jiān)控p53和D-loop區(qū)基因的PCR。
　　1.1所提取DNA OD260/OD280大都在1.7-2.0之間

4、，且提取量隨石蠟包埋組織存放時(shí)間的增加而減少。非癌患者組織切片中DNA含量和腫瘤患者組織切片中DNA含量無(wú)明顯差別。
　　1.2經(jīng)過(guò)多輪的實(shí)驗(yàn)優(yōu)化、驗(yàn)證，確定了p53基因和線粒體DNA的D-loop區(qū)基因不同片段在20μL熒光定量PCR體系中擴(kuò)增的最佳條件。
　　1.3通過(guò)測(cè)序發(fā)現(xiàn)，與非癌患者卵巢p53基因相比，p53基因發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)9個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)127個(gè)。與非癌患者卵巢D-loop基因相比，D-loop區(qū)基因發(fā)現(xiàn)突變位點(diǎn)

5、11個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)165個(gè)。
　　2.外周血、傳代細(xì)胞、卵巢組織及組織切片中p53、線粒體基因差異
　　2.1非癌患者細(xì)胞第一代細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)瓶底部70％面積平均用時(shí)21天，腫瘤細(xì)胞平均用時(shí)18天。從第二代傳至第三代時(shí)，非癌患者卵巢細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部70％面積平均用時(shí)15天，腫瘤細(xì)胞平均用時(shí)12天。采用DAB染色對(duì)上述第三代細(xì)胞進(jìn)行了上皮細(xì)胞特有表面抗原CK19鑒定，結(jié)果顯示均為陽(yáng)性。30例卵巢癌患者中17例卵巢上皮細(xì)胞體外培

6、養(yǎng)成功并傳至第五代，15例非癌患者卵巢細(xì)胞成功培養(yǎng)7例并傳至第五代。
　　2.2結(jié)果顯示:
　　2.2.1非癌患者術(shù)前外周血游離DNA含量為7.7±2.6ng/mL，在17份卵巢癌中，2例Ⅰ期患者含量為26.7±5.4ng/mL;6例Ⅱ期患者為151±29ng/mL;9例Ⅲ到Ⅳ期患者為234±32ng/mL。上皮性卵巢癌患者外周血中游離DNA含量較非癌患者升高明顯。
　　2.2.2新鮮卵巢組織及其石蠟包埋切片對(duì)p53基

7、因、D-loop區(qū)基因突變位點(diǎn)和多態(tài)性位點(diǎn)檢測(cè)效率一致。外周血中游離DNA檢出效率稍差，與前兩者相比，有4個(gè)p53基因多態(tài)性位點(diǎn)、2個(gè)D-loop區(qū)突變位點(diǎn)及11個(gè)D-loop區(qū)多態(tài)性位點(diǎn)未被檢測(cè)。但對(duì)于p53的7號(hào)外顯子44位密碼子由C突變?yōu)锳和D-loop區(qū)73位密碼子由A突變?yōu)镚兩者聯(lián)合檢測(cè)，仍可實(shí)現(xiàn)對(duì)17份陽(yáng)性標(biāo)本的全檢出。顯示出p53的7號(hào)外顯子44位密碼子由C突變?yōu)锳和D-loop區(qū)73位密碼子由A突變?yōu)镚兩者聯(lián)合作為外周血

8、游離DNA檢測(cè)卵巢癌的潛在可能。
　　2.2.3第三代細(xì)胞較原卵巢組織新增p53基因突變位點(diǎn)2個(gè)，多態(tài)性位點(diǎn)11個(gè)，新增D-loop區(qū)基因多態(tài)性位點(diǎn)4個(gè)，提示傳代造成了基因的改變。但發(fā)現(xiàn)的潛在的上皮性卵巢癌p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測(cè)指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)位點(diǎn)未發(fā)生改變，可作為后續(xù)細(xì)胞水平研究的檢測(cè)指標(biāo)。
　　結(jié)論：
　　選取臨床確診的90例上皮性卵巢癌患者和76例非癌患者的卵巢組織標(biāo)本作為研究對(duì)

9、象，通過(guò)對(duì)其p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因的測(cè)序，發(fā)現(xiàn)了潛在的上皮性卵巢癌p53基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測(cè)指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)。對(duì)其中的45例病患的卵巢組織、組織切片、外周血及傳代卵巢上皮細(xì)胞標(biāo)本顯示進(jìn)行進(jìn)一步研發(fā)，發(fā)現(xiàn)上皮性卵巢癌患者外周血中游離DNA含量較非癌患者升高明顯，石蠟包埋切片和外周血中游離DNA可替代新鮮卵巢組織作為基因多態(tài)性檢測(cè)對(duì)象。傳代雖然會(huì)造成基因的多態(tài)性變化，但發(fā)現(xiàn)的潛在的上皮性卵巢癌p5

10、3基因、線粒體D-loop區(qū)基因多態(tài)性檢測(cè)指標(biāo)和易耐藥復(fù)發(fā)的檢測(cè)指標(biāo)位點(diǎn)未發(fā)生改變，可作為后續(xù)細(xì)胞水平研究的檢測(cè)指標(biāo)。
　　第二部分：p53、線粒體基因多態(tài)性與二甲雙胍在卵巢癌化療中增敏關(guān)系
　　目的：
　　利用卵巢細(xì)胞體外傳代第三代細(xì)胞進(jìn)行耐藥馴化，模擬多次化療耐藥的現(xiàn)象，進(jìn)而觀察二甲雙胍在紫杉醇、卡鉑治療中的增敏作用。通過(guò)檢測(cè)p53、D-loop基因多態(tài)性，研究p53、D-loop基因多態(tài)性與卵巢癌耐藥、二甲雙胍增

11、敏的關(guān)系。在動(dòng)物模型中也采用患者卵巢組織細(xì)胞傳代第三代細(xì)胞建模，并采用非癌患者體血藥濃度用藥，模擬人在正常用藥下二甲雙胍對(duì)化療的增敏作用，觀察p53、D-loop基因多態(tài)性對(duì)增敏效果的影響。
　　方法：
　　1.二甲雙胍在傳代卵巢癌細(xì)胞中的增敏作用
　　選第一部分第二章成功傳代5次的17株癌變卵巢組織的第三代傳代細(xì)胞作為研究對(duì)象，并用SKOV3細(xì)胞株作為陽(yáng)性對(duì)照。將每株細(xì)胞在稀釋為5×105/mL和1×105/mL兩個(gè)

12、濃度在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上各鋪48孔。5×105/mL的48孔細(xì)胞進(jìn)行耐藥馴化，1×105/mL作為未馴化對(duì)照。耐藥馴化采用短時(shí)間間歇式馴化，并按照耐藥馴化所用紫杉醇(0、0.6、1.2μg/mL)、卡鉑(0、10、25μg/mL)、二甲雙胍（0、0.5、2.5μg/mL）不同水平的組合采用三因素三水平正交實(shí)驗(yàn)的方法分為9個(gè)組別。在三次馴化后，仍按正交實(shí)驗(yàn)組別分別加入馴化時(shí)所用藥物并培養(yǎng)72h，通過(guò)CCK8顯色觀察對(duì)實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞的抑制率，研

13、究二甲雙胍在卵巢癌不同化療中的增敏作用。
　　2.二甲雙胍在卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤中的增敏作用
　　用第一部分第二章成功傳代5次的17例癌變卵巢組織的第三代傳代細(xì)胞懸液接種子裸鼠皮下，構(gòu)建卵巢癌裸鼠移植瘤，比較卡鉑、紫杉醇聯(lián)合用藥與二甲雙胍、卡鉑、紫杉醇聯(lián)合用藥效果的差別。
　　以移植瘤直徑不小于6mm為建模成功的標(biāo)準(zhǔn)，將各株細(xì)胞中建模成功的裸鼠分別隨機(jī)分為五組:第一組采用生理鹽水作為對(duì)照;第二組作為低劑量組:二甲雙胍4

14、00μg/只、紫杉醇80μg/只、卡鉑200μg/只;第三組為高劑量組:二甲雙胍400μg/只、紫杉醇400μg/只、卡鉑1000μg/只;第四組為低劑量對(duì)照組:紫杉醇80μg/只、卡鉑200μg/只;第五組為高劑量對(duì)照組:紫杉醇400μg/只、卡鉑1000μg/只。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)對(duì)小鼠進(jìn)行解剖，根據(jù)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組移植瘤體積的大小比值進(jìn)行抑制率計(jì)算。
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍在不同傳代卵巢癌細(xì)胞中的增敏作用
　　1.1

15、對(duì)17株細(xì)胞進(jìn)行耐藥馴化，二甲雙胍具有明顯增敏作用的細(xì)胞12株。這12株細(xì)胞中9株有化療耐藥傾向。
　　1.2利用Exon6-198G+Exon8-67A+D-loop309T+D-loop446A可在12株增敏作用的細(xì)胞中檢測(cè)出11株，檢出率為11/12。利用Exon4-72G+D-loop309T可在12株增敏作用的細(xì)胞中檢測(cè)出8株，均為耐藥株，耐藥菌株檢測(cè)率8/9。
　　1.3二甲雙胍單獨(dú)使用，17株腫瘤細(xì)胞和7株非癌

16、患者細(xì)胞均在72h出現(xiàn)2.72-3.56％不等的抑制，在120h出現(xiàn)3.24-6.83％不等的抑制。二甲雙胍對(duì)細(xì)胞的抑制存在時(shí)間依賴，但不隨二甲雙胍的量改變，提示在這兩個(gè)人體濃度值范圍內(nèi)，二甲雙胍對(duì)細(xì)胞的抑制效果一致，但長(zhǎng)期服用二甲雙胍效果會(huì)好些。
　　2.二甲雙胍在卵巢癌細(xì)胞裸鼠移植瘤中的增敏作用
　　17株細(xì)胞建模成功13株，最終成瘤大小和數(shù)量符合實(shí)驗(yàn)要求的9株。裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，9組中包含細(xì)胞培養(yǎng)易耐藥細(xì)胞5個(gè)(S9、S2

17、7、S29、S1、S17)，其中4個(gè)(S27、S29、S1、S17)對(duì)鉑類有耐藥傾向，2個(gè)(S9、S27)對(duì)紫杉醇有耐藥傾向，1個(gè)(S9)鉑類、紫杉醇聯(lián)合耐藥傾向），紫杉醇、卡鉑敏感細(xì)胞4個(gè)。對(duì)于紫杉醇、卡鉑聯(lián)合用藥量高低進(jìn)行比較，無(wú)論是否耐藥，均存在明顯的劑量正相關(guān)性。對(duì)于各劑量組中添加二甲雙胍的對(duì)照來(lái)看，S11、S6、S19、S26四株對(duì)紫杉醇、卡鉑敏感細(xì)胞中S19、S26表現(xiàn)出對(duì)二甲雙胍不敏感。其他細(xì)胞株的裸鼠實(shí)驗(yàn)表明，低劑量的紫

18、杉醇、卡鉑在加入口服二甲雙胍后對(duì)其細(xì)胞抑制率增高明顯。與細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。
　　結(jié)論：
　　二甲雙胍對(duì)卵巢癌耐藥細(xì)胞具有一定的逆轉(zhuǎn)耐藥作用，p53的E7-44A和D-loop區(qū)73G兩者聯(lián)合檢測(cè)出的卵巢癌陽(yáng)性細(xì)胞中具有Exon4-72G、D-loop309T的多態(tài)性的容易復(fù)發(fā)，且對(duì)二甲雙胍更為敏感，對(duì)于Exon6-198G、Exon8-67A、D-loop309T、D-loop446A基因型的卵巢癌細(xì)胞可使用二甲雙胍進(jìn)行