p16，p21，p27基因多態(tài)性與上皮性卵巢癌易感性關(guān)聯(lián)的研究.pdf

1、目的：卵巢癌是常見的婦科惡性腫瘤之一，90％以上來自上皮組織。由于卵巢癌迄今仍無完善的早期診斷方法和有效的晚期治療手段，成為威脅廣大婦女生命和健康的主要疾病。p16，p21，p27基因是大家公認(rèn)的抑癌基因，與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展及預(yù)后密切相關(guān)。目前，國內(nèi)外關(guān)于p16，p21，p27基因多態(tài)性與上皮性卵巢癌易感性關(guān)系的報(bào)道較少，這些抑癌基因多態(tài)性的研究可望成為卵巢癌早期診斷的重要線索。 本實(shí)驗(yàn)對(duì)p16，p21，p27三種基因的四個(gè)不

2、同多態(tài)性位點(diǎn)與卵巢癌易感性的關(guān)系進(jìn)行了研究，探討這三種基因的多態(tài)性在我國北方漢族女性卵巢癌人群中的分布情況，為卵巢癌的預(yù)測(cè)及發(fā)病機(jī)理提供依據(jù)。 方法： 1.樣本采集本實(shí)驗(yàn)采用病例-對(duì)照研究方法對(duì)卵巢癌與p16，p21，p27基因多態(tài)性的相關(guān)性進(jìn)行研究。168例上皮性卵巢癌患者為2001.12-2005.11于河北醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療的北方籍漢族患者。所有卵巢癌患者均經(jīng)組織病理學(xué)診斷為上皮性卵巢癌。根據(jù)病理類型

3、分組包括漿液性卵巢癌55例，黏液性卵巢癌14例，宮內(nèi)膜樣癌45例，低分化腺癌22例。采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)的臨床病理分期方法，將卵巢癌分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期，將Ⅰ、Ⅱ期定義為早期，Ⅲ、Ⅳ期定義為晚期，早期卵巢癌59例，晚期卵巢癌77例。243例正常對(duì)照為同一地區(qū)的健康漢族女性個(gè)體。卵巢癌患者組與健康對(duì)照組人群在征得本人或其家屬同意后，無菌操作下采集外周靜脈血5ml，采用蛋白酶K-氯化鈉鹽析法提取基因組DNA。 2.實(shí)驗(yàn)方法

4、采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法進(jìn)行基因型檢測(cè)。具體如下： 2.1引物：擴(kuò)增p16基因C540G和C580T多態(tài)位點(diǎn)的上游引物序列為5'-GATGTGCCACACATCTTTGACCT-3'，下游引物序列為5'-CTACGAAAGCGGGGTGGGTTGT-3'，擴(kuò)增片段為181bp。 2.2反應(yīng)體系：共為25μl，包括10×PCR緩沖液(含15mM的MgCl2)2.5μl，染料2.5μl，

5、10mmol/LdNTPs0.5μl，25μmol/L引物各()0μl，Taq酶(5U/μl)0.5μl，模板DNA100ng，滅菌去離子水15μl。 2.3PCR反應(yīng)條件為：94℃10分鐘預(yù)變性后，采用熱啟動(dòng)加Taq-DNA-聚合酶，然后94℃變性45S，62℃退火45秒鐘，72℃延伸1分鐘，35個(gè)循環(huán)后，72℃繼續(xù)延伸7分鐘。 2.4酶切：分別用10UMspⅠ(C540G)和10UHaeⅢ(C580T)對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)

6、行酶切，3()℃水浴消化過夜。 2.5觀察結(jié)果：反應(yīng)結(jié)束后，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)3％的瓊脂糖，在1×TAE緩沖液中電泳，同時(shí)上樣陰性對(duì)照，并選擇100bpDNAmarker平行電泳，溴化乙錠(EB)染色，在紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。 擴(kuò)增p21T/C和p27V/G基因型多態(tài)性位點(diǎn)實(shí)驗(yàn)方法同上。 3.統(tǒng)計(jì)方法病例及對(duì)照組的年齡比較采用t檢驗(yàn)，SNP基因型及等位基因型分布比較采用χ22檢驗(yàn)。應(yīng)用非條件Logistic回歸模型統(tǒng)計(jì)經(jīng)

7、性別、年齡調(diào)整后的OR值和95％可信區(qū)間。統(tǒng)計(jì)分析應(yīng)用SPSS11.5軟件包。 結(jié)論： 1.本實(shí)驗(yàn)研究未發(fā)現(xiàn)p16基因C540G和p21基因型多態(tài)與中國北方漢族女性人群上皮性卵巢癌的易感性有關(guān)；而p27V/V純合型可能增加卵巢癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)，p16基因C580T多態(tài)可能與卵巢癌患病風(fēng)險(xiǎn)有相關(guān)性。 2.將卵巢癌患者按病理類型分組后，發(fā)現(xiàn)漿液性卵巢癌與p16基因C580T、p21基因、p27基因多態(tài)性有顯著性差異，而漿

8、液性卵巢癌與p16基因C540G多態(tài)無顯著性差異；黏液性卵巢癌、宮內(nèi)膜樣癌和低分化腺癌與p16基因C540G和C580T、p21基因型、p27基因型多態(tài)無相關(guān)性。在漿液性卵巢癌、黏液性卵巢癌、宮內(nèi)膜樣卵巢癌及低分化腺癌病理類型之間相比較，發(fā)現(xiàn)p16基因C580T多態(tài)位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布均有顯著性差異。 3.將卵巢癌根據(jù)FIGO分期分組后，未發(fā)現(xiàn)p16基因C540G和C580T、p21基因型、p27基因型多態(tài)在早期卵巢