二甲雙胍與ABT-263協(xié)同促進(jìn)p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制研究.pdf

1、腫瘤抑癌基因TP53(tumor protein53)的編碼蛋白p53可以通過促進(jìn)細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，介導(dǎo)細(xì)胞衰老等多種方式發(fā)揮抑癌作用。p53功能在大約半數(shù)的人類腫瘤中都存在障礙，主要原因是由于TP53基因缺失或基因突變（包括顯性失活、雜合性缺失等），在某些腫瘤類型中，p53蛋白也會因過度降解而被廢除正常功能。無論是TP53基因完全缺失，顯性失活，雜合性缺失，或者p53蛋白功能被廢除，都可以導(dǎo)致野生型p53功能喪失，這些可以統(tǒng)

2、稱為p53功能缺陷。臨床前研究表明p53功能缺陷的腫瘤模型對多種抗腫瘤藥物產(chǎn)生化療抵抗，且p53功能缺陷的病人在臨床中的預(yù)后普遍較差。盡管在很多實驗?zāi)Ｐ椭?，重新活化p53展現(xiàn)出了一定的抑癌效果，但在臨床中針對p53功能缺陷的腫瘤仍然缺少有效的靶向治療措施。這一重要的問題亟待解決。
　　小分子BCL-2抑制劑ABT-263（具有口服活性）及其類似物ABT-737可以特異地靶向BCL-2家族抗凋亡蛋白（BCL-XL和BCL-2等），釋

3、放BCL-2家族促凋亡蛋白活性，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。在臨床前研究中，ABT-263作為單藥或聯(lián)合其他腫瘤治療藥物均展示了較好的效果。而且在多種類型腫瘤中以ABT-263為基礎(chǔ)的臨床試驗正在開展中且具有潛在的治療前景。目前，ABT-263或ABT-737治療過程中誘導(dǎo)BCL-2家族另一個抗凋亡蛋白MCL-1的水平升高是其主要抵抗因素之一。此外，有研究表明ABT-737單藥對于p53功能缺陷的基因工程鼠的腫瘤發(fā)生發(fā)展只有很小的抑制作用，且

4、p53的功能缺陷嚴(yán)重削弱了ABT-737的促凋亡作用。BCL-XL/BCL-2抑制劑ABT-263在p53功能缺陷型腫瘤中的凋亡抵抗機(jī)制有待進(jìn)一步闡明，相應(yīng)增敏措施也亟待解決。
　　二甲雙胍(metformin)是臨床上廣泛使用的糖尿病治療藥物，近年來其在腫瘤研究中的作用備受關(guān)注。二甲雙胍發(fā)揮抑癌作用的機(jī)制之一是通過抑制哺乳動物雷帕霉素靶點復(fù)合體1(mTORC1)。有趣的是，p53對于二甲雙胍發(fā)揮抗癌效應(yīng)的作用是雙向的：有研究報道

5、，p53對于二甲雙胍在乳腺癌細(xì)胞中誘導(dǎo)凋亡和衰老等是必須的。而另外的研究報道，二甲雙胍對p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞也具有殺傷作用。基于以上研究報道，探究ABT-263在p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞中的凋亡抵抗因素，及二甲雙胍是否可以和ABT-263協(xié)同殺傷p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞，是一項新穎而有意義的研究。
　　目的：
　　本研究以p53功能缺陷型及p53野生型腫瘤細(xì)胞系為模型，擬通過相關(guān)實驗方法，探討二甲雙胍及ABT-263聯(lián)合

6、使用對其凋亡的誘導(dǎo)作用及相應(yīng)分子機(jī)制。以期為二甲雙胍和ABT-263的抗腫瘤作用提供新的依據(jù)，同時為基于聯(lián)合應(yīng)用二甲雙胍和ABT-263特異性靶向治療p53功能缺陷型腫瘤提供理論基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.在p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞系中，使用不同濃度梯度的二甲雙胍及ABT-263組合，通過CCK-8試驗檢測細(xì)胞活力，確定最適的聯(lián)用濃度;進(jìn)而通過流式細(xì)胞術(shù)，Western blot檢測剪切型PARP等方法分析凋亡，探究在p53

7、功能缺陷型細(xì)胞系中二甲雙胍和ABT-263是否具有協(xié)同促凋亡作用;
　　2.通過Western blot篩選可能介導(dǎo)二甲雙胍和ABT-263協(xié)同作用的BCL-2家族及IAPs家族抗凋亡分子，進(jìn)而分別轉(zhuǎn)染相應(yīng)的干擾序列或過表達(dá)質(zhì)粒，通過模擬和回復(fù)實驗證實這些分子所起的作用;
　　3.應(yīng)用蛋白質(zhì)免疫共沉淀(Co-IP)技術(shù)，探究在二甲雙胍和ABT-263的單獨及聯(lián)合作用下，BCL-2家族抗凋亡與促凋亡分子之間的相互作用變化以及I

8、APs家族分子與CASPASE家族分子之間的相互作用變化;
　　4.應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)，探究二甲雙胍及ABT-263單獨或聯(lián)用對MCL-1，XIAP及SURVIVIN等mRNA表達(dá)水平的影響;
　　5.應(yīng)用翻譯抑制劑CHX，探究二甲雙胍及ABT-263單獨或聯(lián)用對MCL-1，XIAP及SURVIVIN等的蛋白水平是否存在翻譯后（即蛋白降解水平）的影響;
　　6.使用Western blot篩選可能介導(dǎo)二甲雙胍和AB

9、T-263協(xié)同促凋亡作用的翻譯相關(guān)信號通路;
　　7.運用Co-IP及7-甲基-GTP帽結(jié)合(m7-GTP cap binding)分析技術(shù)，探究二甲雙胍及ABT-263聯(lián)合應(yīng)用對于cap依賴的蛋白翻譯的作用;
　　8.使用不同的mTOR抑制劑，探索介導(dǎo)二甲雙胍和ABT-263影響cap依賴性翻譯的具體mTOR下游效應(yīng)分子;
　　9.使用HCT-116的p53野生(HCT-116p53+/+)及p53缺失(HCT-11

10、6p53-/-)細(xì)胞對，分別探索聯(lián)用二甲雙胍及ABT-263在p53功能缺陷和正常的腫瘤細(xì)胞中的促凋亡效應(yīng)，進(jìn)而應(yīng)用Western blot分析可能的分子機(jī)制;
　　10.運用Co-IP及m7-GTP cap binding分析技術(shù)，探索在p53功能正常的情況下二甲雙胍和ABT-263單獨及聯(lián)合應(yīng)用對cap依賴的翻譯的影響;
　　11.分別運用細(xì)胞衰老相關(guān)β半乳糖苷酶染色和qRT-PCR，探索在p53功能缺陷和正常的情況下，

11、二甲雙胍和ABT-263單獨及聯(lián)合應(yīng)用對于細(xì)胞衰老和細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型的影響;
　　12.使用在兩種模型中差異表達(dá)的促癌炎性細(xì)胞因子中和抗體或NF-κB抑制劑，進(jìn)一步證實細(xì)胞衰老相關(guān)分泌因子在介導(dǎo)p53野生型腫瘤細(xì)胞抵抗二甲雙胍聯(lián)用ABT-263促凋亡作用中的重要性;
　　13.建立p53野生型及p53功能缺陷型荷瘤鼠模型，單獨或聯(lián)合使用二甲雙胍及ABT-263探究其對相應(yīng)腫瘤的生長抑制作用，進(jìn)而使用Western blo

12、t解析具體分子機(jī)制;
　　結(jié)果：
　　1.二甲雙胍和ABT-263在多種p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞中可以顯著協(xié)同促進(jìn)細(xì)胞凋亡;
　　2.二甲雙胍通過下調(diào)ABT-263誘導(dǎo)的MCL-1，XIAP及SURVIVIN增敏ABT-263的促凋亡作用;ABT-263通過抑制BCL-XL從而釋放游離BIM進(jìn)而增敏二甲雙胍;
　　3.二甲雙胍通過抑制mTORC1的下游效應(yīng)分子p-4EBP1抑制cap依賴的翻譯，進(jìn)而下調(diào)ABT-2

13、63誘導(dǎo)的MCL-1和SURVIVIN蛋白水平;二甲雙胍同時通過抑制p-EIF4E從而抑制cap非依賴（IRES依賴）的翻譯，進(jìn)而下調(diào)ABT-263誘導(dǎo)的XIAP蛋白水平;
　　4.在p53野生型腫瘤細(xì)胞中，二甲雙胍和ABT-263的聯(lián)合處理異常活化了4EBP1—MCL-1/SURVIVIN信號通路，使得二者無法協(xié)同促凋亡;
　　5.在p53野生型腫瘤細(xì)胞中，p53介導(dǎo)的細(xì)胞衰老相關(guān)分泌表型(SASP)異?；罨?EBP1—

14、MCL-1/SURVIVIN通路，導(dǎo)致對二甲雙胍和ABT-263的聯(lián)用治療抵抗;
　　6.在異種移植裸鼠腫瘤模型中，聯(lián)用二甲雙胍和ABT-263協(xié)同抑制p53功能缺陷型（而非p53野生型）腫瘤的生長，其機(jī)制與細(xì)胞實驗吻合;
　　結(jié)論：
　　在p53功能缺陷型腫瘤細(xì)胞中，二甲雙胍與ABT-263可以通過整合凋亡機(jī)器和翻譯機(jī)器協(xié)同誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長;而在p53野生型腫瘤細(xì)胞中，二者無協(xié)同促凋亡作用。本研究為以二甲雙