二甲雙胍在血管內(nèi)皮保護(hù)中的作用及機(jī)制的探討

1、<p>　　二甲雙胍對(duì)磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶和一氧化氮含量的影響</p><p>　　衛(wèi)曼曼 鄢文海王留義（1.鄭州大學(xué)病理學(xué)與病理生理學(xué)，2.鄭州大學(xué)干細(xì)胞研究中心，3 .河南省人民醫(yī)院心內(nèi)科，鄭州，450000）</p><p>　　[摘　要]　目的 探討二甲雙胍對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells）的磷酸化腺苷酸

2、活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase ,AMPK）表達(dá)和一氧化氮含量的影響。方法 將體外培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分為六組：空白對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)）、二甲雙胍（Metformin ，Met）2mmol/l組、軟脂酸（Palmitic acid ，PA）300μmol/l組、軟脂酸300μmol/l+二甲雙胍2mmol/l組、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（5-Aminoimidazole-4-carbo

3、xamide -4carboxamide-ribo-nucle-oside, AICAR）1mmol/l組、軟脂酸300μmol/l+ AICAR 1mmol/l組，經(jīng)孵育24h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液，分別觀測(cè)二甲雙胍用western blot方法測(cè)定各組的磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶的表達(dá)，采用硝酸鹽還原法觀察各組培養(yǎng)上清液中的一氧化氮的含量。結(jié)果 與空白對(duì)照組比較，Met組AMPK的磷酸化表達(dá)水平升高，培養(yǎng)上清液</p>

4、<p>　　[關(guān)鍵詞]　動(dòng)脈粥樣硬化；內(nèi)皮功能；二甲雙胍；人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞；腺苷酸活化蛋白激酶；一氧化氮</p><p>　　[中圖法分類號(hào)] R363</p><p>　　Effects of metformin on the expression of phospha AMPK, and content of nitric oxide</p><p&g

5、t;　　Wei Manman,Yan Wenhai,Wang Liuyi(1 Department of Pathology and Pathophysiology,Medical School of Zhengzhou University;2 The Stem Cells Research Cente of Zhengzhou University; 3 Henan Provincial People's Hospital,

6、 Zhengzhou,450000)</p><p>　　[Abstract] Objective To investigate whether metformin can improve the endothelial function through activating AMP-activated protein kinase in human umbilical vein endothelial cel

7、ls. 　　Methods　Human umbilical vein endothelial cells were cultured in vitro. The study was designated to 6 groups :control group (conventional culture); metformin group(2mmol/l) ;palmatic acid group(300μmol/l); metformin

8、+palmatic acid group(2mmol/l+300μmol/l); AICAR group （1mmol/l）； palmatic acid+AICAR group （300μmol/l+</p><p>　　[Key words] Atheriosclerosis；Endothelial Function；Metformin；Human Umbilical Vein Endothelial Cel

9、l ；AMP-activated protein kinase；Nitric Oxide</p><p>　　Supported by the Tackle Key Program in Science and Technology of Henan Province .Corresponding author:Wang liuyi,Tel:13937198728,E-mail:</p><p

10、>　　動(dòng)脈粥樣硬化（atheriosclerosis, As）導(dǎo)致的心腦血管病變被認(rèn)為是威脅人類健康的首位疾病。內(nèi)皮功能障礙是As血管并發(fā)癥的始動(dòng)環(huán)節(jié)。已有數(shù)據(jù)證實(shí)，口服降糖藥物二甲雙胍可以改善血管功能，在大規(guī)模臨床試驗(yàn)中降低糖尿病病人心血管終點(diǎn)事件的發(fā)生率[1]，具有獨(dú)立于降糖作用以外的血管保護(hù)作用。有研究提示二甲雙胍和羅格列酮對(duì)機(jī)體代謝的影響部分通過AMPK途徑。本研究以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為研究對(duì)</p><

11、p>　　[基金項(xiàng)目] 河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目</p><p>　　[通信作者] 王留義，電話：13937198728,E-mail:wly2000@126.com</p><p>　　象，觀察二甲雙胍及AMPK的激活劑AICAR對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞AMPK磷酸化水平和NO含量的影響，以探討二甲雙胍改善內(nèi)皮功能障礙的可能機(jī)制。</p><p><b>　　1 材

12、料與方法</b></p><p><b>　　1.1 材料</b></p><p>　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)株由鄭州大學(xué)干細(xì)胞研究中心提供；胎牛血清購(gòu)自上海尚寶生物工程有限公司；RPMI1640購(gòu)自HyClone公司；胰蛋白酶購(gòu)自索萊寶公司；二甲雙胍原粉、軟脂酸、AICAR均購(gòu)自Simga公司；兔抗人磷酸化AMPKa（Thr-172）抗體購(gòu)自S

13、anta公司；一氧化氮（NO）測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京市建成生物工程研究所；磷酸化蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物公司；</p><p>　　1.2 細(xì)胞株及細(xì)胞培養(yǎng)</p><p>　　人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVECs）株由鄭州大學(xué)干細(xì)胞研究中心提供，采用常規(guī)培養(yǎng)，將凍存的HUVECs株解凍復(fù)蘇后，種植在含15%FBS、2mM谷氨酰胺、0.1mg/ml肝素、0.05mg/ml內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子的RP

14、MI-1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%的飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以后每2~3d換液一次。待細(xì)胞生長(zhǎng)至單層融合狀態(tài)后，用0.25%胰蛋白酶消化傳代。試驗(yàn)時(shí)所用細(xì)胞均為對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。</p><p><b>　　1.3 設(shè)計(jì)分組</b></p><p>　　取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，按傳代方法制成單細(xì)胞懸液，進(jìn)行如下分組：空白對(duì)照組（常規(guī)培養(yǎng)）、二甲雙胍（Met）2mmol/l組、

15、軟脂酸（PA）300μmol/l組、軟脂酸300μmol/l+二甲雙胍2mmol/l組、5-氨基咪唑-4-甲酰胺核糖核苷酸（AICAR）1mmol/l組、軟脂酸300μmol/l+ AICAR 1mmol/l組，經(jīng)孵育24h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)上清液。 </p><p><b>　　1.4實(shí)驗(yàn)方法</b></p><p>　　1.4.1 NO測(cè)定：利用硝酸還原酶法通過

16、顯色深淺測(cè)定培養(yǎng)液中NO濃度的高低。將HUVECs按上述1.3設(shè)計(jì)分組進(jìn)行干預(yù)后，取上清液，采用硝酸鹽還原法測(cè)定NO濃度。按試劑盒說明書步驟測(cè)定NO。根據(jù)公式NO（μmol /L ）= （樣品管吸光度- 空白管吸光度）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度-空白管吸光度）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（100μmol /L ）×樣品測(cè)試前稀釋倍數(shù)計(jì)算各樣品管濃度。</p><p>　　1.4.2 HUVECs細(xì)胞磷酸化蛋白提?。号?/p>

17、養(yǎng)瓶?jī)?nèi)的細(xì)胞長(zhǎng)滿后，吸取培養(yǎng)基，用冰的PBS洗兩次；制備成單細(xì)胞懸液，離心，再用PBS洗兩次；每ml冷Lysis Buffer加入10μl磷酸酶抑制劑，1μl蛋白酶抑制劑和10μlPMSF，混勻，冰上保存數(shù)分鐘待用；每3×細(xì)胞加入上述配制好的冷Lysis Buffer加入0.5ml；4℃搖床平臺(tái)上，溫和振蕩15min；14000rpm,4℃離心15min，取上清為磷酸化蛋白提取物。以每細(xì)胞加入buffer(上樣緩沖液)100μ

18、l，95℃煮沸10min，室溫放置10~20min，溶解沉淀。將溶解后液體（即總蛋白）放入-20℃冰箱保存。</p><p>　　1.4.3 Western Blot免疫印跡法檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)磷酸化AMPK蛋白的表達(dá)水平：取100μg蛋白樣品在10﹪的SDS-PAGE膠電泳，100V電壓下轉(zhuǎn)膜2h將蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜上，將轉(zhuǎn)膜后的NC膜置于5﹪的BSA封閉液中4℃封閉過夜。次日，用0.1％的TBST洗膜3次，每次10

19、min。兔抗人磷酸化AMPKα一抗用含5％BSA的TBST稀釋1000倍，將膜裝入塑料袋中，加入一抗，封口，搖床震蕩，37℃條件下孵育1h。0.1％TBST洗膜3次，每次10min。HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗用含5％BSA的TBST稀釋1000倍，將膜裝入塑料袋中，加入二抗，封口搖床震蕩，37℃條件下孵育45min。0.1％TBST洗膜3次，每次10min。發(fā)光物質(zhì)A、B各1ml，混勻后作用于膜1min，保鮮膜包裹NC膜，曝光。</p

20、><p><b>　　1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析</b></p><p>　　用SPSS13.0軟件進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)，組間比較行單因素方差分析，P＜0.05表示差異有顯著性。</p><p><b>　　2 結(jié)果</b></p><p>　　2.1 二甲雙胍對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶表達(dá)的影響&l

21、t;/p><p>　　與空白對(duì)照組相比，Met組的P-AMPK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與PA組相比，PA+Met組的P-AMPK蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）。 </p><p>　　圖1.不同干預(yù)因素作用下HUVEC 表達(dá)P-AMPK蛋白的水平</p><p>　　a為PA組，b為空白對(duì)照組，c為AICAR組，d為AICAR+

22、PA組, e為Met組，f為Met+PA組</p><p>　　注：所有數(shù)據(jù)以+s表示，n=6與對(duì)照組比較，Met組P﹤0.05，AICAR組P﹤0.05；與軟脂酸組比較，Met組P﹤0.05，AICAR組 P﹤0.05</p><p>　　2.2 二甲雙胍對(duì)軟脂酸誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)上清液中一氧化氮的影響</p><p>　　二甲雙胍干預(yù)后培養(yǎng)上清液中NO生

23、成增加（P＜0.01）。</p><p>　　二甲雙胍對(duì)培養(yǎng)液中一氧化氮的影響</p><p>　　圖2.不同干預(yù)因素作用下對(duì)HUVEC 細(xì)胞培養(yǎng)液中一氧化氮的影響</p><p>　　注：所有數(shù)據(jù)以+s表示，n=6.與對(duì)照組比較，a為P﹤0.01，b為P﹤0.01；與軟脂酸組比較，c為P﹤0.01，d為P﹤0.01</p><p><

24、b>　　3 討論</b></p><p>　　動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis, As）是冠心病等多種嚴(yán)重威脅人類健康疾病的共同病理基礎(chǔ)，已經(jīng)成為我國(guó)主要的死亡原因。內(nèi)皮功能對(duì)心血管功能的正常發(fā)揮具有重要的調(diào)節(jié)作用，內(nèi)皮細(xì)胞的異常往往是導(dǎo)致心血管疾病發(fā)生的關(guān)鍵因素[3，5]，并且是As血管并發(fā)癥形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。AMPK作為一種重要的蛋白激酶被稱為“能量感受器”，[6]可以通過抑制糖

25、原、脂肪和膽固醇的合成，促進(jìn)脂肪酸氧化、葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)調(diào)節(jié)糖脂代謝；通過磷酸化激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶，產(chǎn)生一氧化氮，調(diào)節(jié)血管張力；AMPK的激活減少cAMP 介導(dǎo)的上皮氯化物的分泌，從而減輕炎癥反應(yīng)[7]。因此，AMPK與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展有密切聯(lián)系。最近的臨床數(shù)據(jù)證實(shí)，二甲雙胍除降糖外，尚可改善內(nèi)皮功能，降低糖尿病病人心血管終點(diǎn)事件的發(fā)生率。有研究提示，二甲雙胍這種改善內(nèi)皮功能的影響部分通過AMPK通路[2]。軟脂酸（PA）是體內(nèi)游離

26、脂肪酸(free fatty acid,FFA)中主要成分之一,而游離脂肪酸(FFA)是體內(nèi)血液中血脂的重要組成，F(xiàn)FA廣泛參與了血管內(nèi)皮功能受損的各個(gè)病理生理過程，已成為糖尿病引起的動(dòng)脈粥樣硬化機(jī)制之一。AI</p><p>　　NO由內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生，介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管舒張作用，并且眾多內(nèi)皮依賴性血管保護(hù)作用幾乎都是通過NO來實(shí)現(xiàn)的，如抗白細(xì)胞黏附、抗血小板聚集、抗平滑肌細(xì)胞增殖等。NO 合成減少將導(dǎo)致內(nèi)皮功

27、能障礙，受損內(nèi)皮細(xì)胞合成NO 減少，從而形成惡性循環(huán)，導(dǎo)致AS的發(fā)生發(fā)展[4，8]。有研究顯示在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展過程中內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA 表達(dá)降低及NO 生成減少[9]。由此可見，在內(nèi)皮細(xì)胞的血管保護(hù)作用中，NO處于非常重要的地位。</p><p>　　本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組比，Met組中AMPKα磷酸化水平升高，提示二甲雙胍可激活HUVEC中的AMPK。并且在此基礎(chǔ)上我們進(jìn)一步評(píng)估了這種激活效應(yīng)在

28、二甲雙胍改善HUVEC功能中的作用，與對(duì)照組比，PA組中AMPKα磷酸化水平降低，提示AMPK的失活參與軟脂酸所致的HUVEC功能下降。而與PA組比，PA+Met組AMPKα磷酸化水平升高。AMPK磷酸化的變化與HUVEC功能變化的一致性強(qiáng)烈提示二甲雙胍可能通過AMPK途徑直接改善HUVEC的功能。</p><p>　　本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍干預(yù)的HUVEC，培養(yǎng)上清液中NO生成增加。證實(shí)了二甲雙胍通過激活腺苷

29、酸活化蛋白激酶（AMPK）通路，通過調(diào)節(jié)eNOS活性，刺激NO的產(chǎn)生，改善內(nèi)皮功能。二甲雙胍作用于內(nèi)皮細(xì)胞中的AMPK-eNOS通路，即通過激活內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK，發(fā)揮調(diào)節(jié)內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）活性，進(jìn)而促進(jìn)NO的產(chǎn)生，改善內(nèi)皮功能[10，11]。二甲雙胍與內(nèi)皮細(xì)胞膜表面的受體以及細(xì)胞內(nèi)的銜接子結(jié)合后激活A(yù)MPK通路，發(fā)揮作用包括增加NO合成的關(guān)鍵酶eNOSmRNA的穩(wěn)定性，延長(zhǎng)其半衰期；促進(jìn)eNOS與Hsp90結(jié)合(后者是存在于

30、真核生物和細(xì)菌中的一種重要分子伴侶)，Hsp90與eNOS結(jié)合后能增加酶的催化活性，最終刺激eNOS絲氨酸1177位磷酸化，從而導(dǎo)致NO生成增加。</p><p>　　本研究結(jié)果顯示二甲雙胍能通過激活內(nèi)皮細(xì)胞的AMPK通路，一氧化氮生成增加，從而保護(hù)血管內(nèi)皮功能，部分解釋二甲雙胍抑制As發(fā)生的可能機(jī)制。</p><p><b>　　參考文獻(xiàn)：</b></p>

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