二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱抑制人胰腺癌細胞株CFPAC-1生長及機制的實驗研究.pdf

1、本文從以下及部分進行了論述。
　　第一部分二甲雙胍對人胰腺癌細胞株CFPAC-1的影響及機制
　　目的:研究二甲雙胍(Metformin,Met)在體外對人胰腺癌細胞株CFPAC-1生長增殖、凋亡的影響,并初步探討其可能的作用機制。
　　方法:在體外培養(yǎng)人胰腺癌細胞株CFPAC-1,應(yīng)用不同濃度的Met(0、1、2.5、5、10、20、40、60mmol/L)進行干預(yù)24、48、72h。用細胞增殖與毒性檢測法(CCK-

2、8)檢測OD值,計算對照組和各實驗組CFPAC-1細胞的抑制率,并計算最適宜的Met IC50;取Met濃度為0、10、20、40mmol/L處理胰腺癌CFPAC-1細胞48h后進行流式細胞術(shù)分析細胞周期變化;AnnexinV/PI雙染法檢測細胞凋亡率;反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測FAS mRNA、Cyclin D1 mRNA、Bc

3、l-xl mRNA、Bax mRNA、Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA表達水平的變化;蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測P-AMPK、FAS、Cyclin D1、Bcl-xl、Bax、Survivin、Caspase-3蛋白表達變化。
　　結(jié)果:(1)CCK-8法顯示Met可明顯抑制CFPAC-1細胞的增殖,呈濃度—時間依賴性(P<0.05)。
　　(2)流式細胞術(shù)及AnnexinV/PI早

4、期凋亡檢測顯示:CFPAC-1細胞經(jīng)Met作用48小時后,細胞周期G0/G1期比例上升,從(42.89±1.02)％上升至(65.98±0.27)％,(P<0.05)。細胞凋亡明顯,以早期凋亡為主,10mmol/L濃度下早期凋亡率為(13.77±1.31)％,20mmol/L濃度下為(22.63±1.45)％,而40mmol/L濃度下為(32.97±3.19)％,凋亡率與Met濃度呈正相關(guān)(P<0.05)。
　　(3)RT-PCR

5、檢測FAS mRNA、Cyclin D1 mRNA、Bcl-xl mRNA、Bax mRNA、Survivin mRNA、Caspase-3 mRNA表明CFPAC-1細胞經(jīng)Met作用48小時后,FAS mRNA、Cyclin D1 mRNA、Bcl-xl mRNA、Survivin mRNA的表達呈濃度依賴性下降,Bax mRNA、Caspase-3 mRNA呈濃度依賴性上升,各濃度組與對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

6、r>　　(4)Western Blot結(jié)果顯示Met作用于CFPAC-1細胞48h后可使細胞中的P-AMPK蛋白表達增強,FAS、Cyclin D1表達減弱;Bcl-xl、Survivin表達下調(diào),Bax、Caspase-3表達上調(diào),差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:Met呈濃度—時間依賴性抑制胰腺癌CFPAC-1細胞的生長,其機制可能是激活A(yù)MPK信號通路,從而下調(diào)FAS表達影響細胞代謝、下調(diào)Cyclin D1表達

7、阻滯細胞周期于G0/G1期從而抑制細胞增殖;并且還能誘導(dǎo)細胞發(fā)生早期凋亡。
　　第二部分二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱對人胰腺癌細胞株CFPAC-1的影響
　　目的:探討二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱(Gemcitabine,GEM)對人胰腺癌細胞株CFPAC-1的協(xié)同抑制作用及可能機制。
　　方法:以濃度為20mmol/L的二甲雙胍聯(lián)合低濃度(5μmol/L)的吉西他濱處理對數(shù)生長期的人胰腺癌細胞株CFPAC-1,應(yīng)用CCK-8法檢測O

8、D值,計算對照組和各實驗組CFPAC-1細胞的增殖抑制率;AnnexinV/PI雙染法檢測細胞早期凋亡情況;RT-PCR檢測細胞凋亡因子Bcl-xl、Bax、Survivin、Caspase-3的mRNA表達水平;蛋白質(zhì)印跡法(Westen Blot)檢測凋亡蛋白Bcl-xl、Bax、Survivin、Caspase-3的表達水平。
　　結(jié)果:Met和GEM都能有效地抑制人胰腺癌CFPAC-1細胞增殖,二者聯(lián)合作用后抑制效應(yīng)顯著增

9、強。Met組作用CFPAC-1細胞48h后細胞早期凋亡為(24.53±2.18)％,GEM組為(22.37±1.61)％,聯(lián)合組為(52.07±2.81)％。Met組、GEM組及聯(lián)合組Bcl-xl、Survivin mRNA及蛋白表達下調(diào),Bax、Caspase-3mRNA及蛋白表達上調(diào),各組與對照組、聯(lián)合組與單藥組相比均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。
　　結(jié)論:二甲雙胍聯(lián)合吉西他濱對人胰腺癌細胞株CFPAC-1增殖具有協(xié)同抑制作