AURKA蛋白激酶在三陰乳腺癌干細(xì)胞形成血管擬態(tài)中的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的:
　　1.利用無血清懸浮培養(yǎng)法從三陰乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231分離獲得干細(xì)胞球，鑒定其腫瘤干細(xì)胞特性，觀察干細(xì)胞形成血管能力。
　　2.檢測AURKA蛋白激酶在干細(xì)胞球和常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞的表達(dá)，加入AURKA蛋白激酶抑制劑觀察對干細(xì)胞球成血管能力的影響及c-myc、sox-2、E-cadherin、β-catenin的表達(dá)變化。
　　3.在裸鼠移植瘤模型中觀察AURKA蛋白激酶抑制劑對血管生成擬態(tài)及c-myc

2、、sox-2、E-cadherin、β-catenin表達(dá)的影響。
　　研究方法:
　　1.常規(guī)方法培養(yǎng)人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞，并利用無血清懸浮培養(yǎng)法從對數(shù)生長期的乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞分離獲得干細(xì)胞球，RT-PCR檢測干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-myc、sox-2的表達(dá)，三維培養(yǎng)觀察干細(xì)胞球形成血管能力。
　　2.Western blot檢測AURKA蛋白激酶在干細(xì)胞和常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞是否存在差異表達(dá)，利用干細(xì)胞

3、球進(jìn)行三維培養(yǎng)并加入AURKA蛋白激酶抑制劑觀察對成血管能力的影響，RT-PCR檢測在加入AURKA蛋白激酶抑制劑后c-myc、sox-2、E-cadherin、β-catenin的表達(dá)變化。
　　3.選取5周齡的BALB/C-nu雌裸鼠20只，將無血清懸浮培養(yǎng)獲得的MDA-MB-231干細(xì)胞球1×106個(gè)接種于裸鼠右側(cè)近前肢的皮膚，10天后瘤體積達(dá)到約0.2cm3，按瘤體體積大小分為兩組，對照組給予皮下注射10％2-羥丙基-β-

4、環(huán)糊精/1％碳酸氫鈉（溶解藥物的溶劑），實(shí)驗(yàn)組給予皮下注射MLN-8237/10％2-羥丙基-β-環(huán)糊精/1％碳酸氫鈉，每天測量瘤體體積，給藥10天后，處死裸鼠，收集移植瘤，4％福爾馬林固定。根據(jù)每天測得的瘤體體積繪制腫瘤生長曲線，免疫組化染色觀察給藥組與對照組c-myc、sox-2、E-cadherin、β-catenin的表達(dá)是否存在差異，觀察抗腫瘤藥物AURKA蛋白激酶抑制劑MLN-8237對腫瘤生長和VM形成的影響。
　　

5、研究結(jié)果:
　　1.接種于含生長因子無血清培養(yǎng)液中的乳腺癌細(xì)胞，24h后在倒置相差顯微鏡下可見較小的腫瘤干細(xì)胞球形成，數(shù)量較少，呈類圓形，形狀不規(guī)則，大小不一，結(jié)構(gòu)松散。培養(yǎng)至10-14d，腫瘤干細(xì)胞球數(shù)量增多，形成由數(shù)十個(gè)至上百個(gè)細(xì)胞組成的成熟細(xì)胞球，呈懸浮生長，球體進(jìn)一步增大，呈圓形或卵圓形，折光性強(qiáng)，細(xì)胞連接緊密。人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞經(jīng)于細(xì)胞無血清懸浮培養(yǎng)后，對獲得的乳腺癌干細(xì)胞球進(jìn)行RT-PCR檢測干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因

6、子c-myc、sox-2的表達(dá)情況。結(jié)果顯示無血清懸浮培養(yǎng)獲得的乳腺癌干細(xì)胞球較常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞高表達(dá)干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-myc、sox-2。
　　2.對無血清懸浮培養(yǎng)獲得的乳腺癌干細(xì)胞球和常規(guī)培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞進(jìn)行Westem blot檢測AURKA蛋白激酶表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:利用無血清懸浮培養(yǎng)獲得的乳腺癌干細(xì)胞球中AURKA蛋白激酶表達(dá)升高。采用“ongel”三維培養(yǎng)法觀察細(xì)胞管道形成能力。三維培養(yǎng)48h后可見細(xì)胞呈梭狀或多邊形，

7、伸出細(xì)長偽足，細(xì)胞相互連接形成大量管腔結(jié)構(gòu)。加入AURKA蛋白激酶抑制劑后可見細(xì)胞聚集呈克隆狀，形成管腔結(jié)構(gòu)明顯減少。對乳腺癌干細(xì)胞球和加入AURKA蛋白激酶抑制劑后獲得的乳腺癌干細(xì)胞球進(jìn)行RT-PCR檢測c-myc、sox-2、E-cadherin、β-catenin的表達(dá)情況。結(jié)果顯示無血清懸浮培養(yǎng)獲得的乳腺癌干細(xì)胞球較加入AURKA蛋白激酶抑制劑后乳腺癌干細(xì)胞球高表達(dá)c-myc、sox-2、β-catenin，E-cadherin

8、表達(dá)情況相反。
　　3.裸鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)移瘤模型實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示給藥組腫瘤生長速度顯著低于對照組，癌組織內(nèi)壞死面積較大;c-myc、sox-2、β-catenin在對照組的表達(dá)高于給藥組，E-cadherin在給藥組的表達(dá)高于對照組，給藥組VM的形成少于對照組。
　　結(jié)論:
　　1.利用干細(xì)胞超低吸附培養(yǎng)板無血清懸浮培養(yǎng)可獲得乳腺癌干細(xì)胞球，其干細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子c-myc、sox-2表達(dá)高于常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞。
　　2.AURKA蛋

9、白激酶在乳腺癌干細(xì)胞球中較常規(guī)培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)升高，干細(xì)胞球三維培養(yǎng)可形成血管管道，加入AURKA蛋白激酶抑制劑后成血管能力減弱。AURKA蛋白激酶抑制劑能抑制c-myc、sox-2、β-catenin在乳腺癌干細(xì)胞球的表達(dá)，E-cadherin則情況相反。
　　3.AURKA蛋白激酶抑制劑MLN8237能明顯抑制人乳腺癌裸鼠體內(nèi)移植瘤模型移植瘤的生長，抑制VM的形成，提示AURKA蛋白激酶抑制劑有望成為治療三陰乳腺癌的特異性分子靶向