川崎病血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡和趨化因子及其受體表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　通過(guò)觀察川崎病患兒急性期血清、恢復(fù)期血清和正常兒童血清對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡和趨化因子及其受體表達(dá)的影響，探討川崎病血清和趨化因子在川崎病患兒冠狀動(dòng)脈損傷中的作用及其可能的機(jī)制。
　　方法:
　　1.細(xì)胞培養(yǎng)體外培養(yǎng)HUVECs。
　　2.血清制備分別采集5例在我院明確診斷為典型川崎病患兒急性期（發(fā)熱7d內(nèi)）、靜脈丙種球蛋白治療后（川崎病恢復(fù)期）及本院門(mén)診體檢、年齡相仿的正常健康兒童靜脈血各4 mL

2、。4℃4000轉(zhuǎn)/min離心15min，-80℃凍存待用。實(shí)驗(yàn)前將血清置于4℃解凍，分組合并為川崎病急性期血清組、恢復(fù)期組及正常兒童血清組，所有血清使用0.22μm微孔濾器過(guò)濾后除菌。
　　3.實(shí)驗(yàn)分組用含10％的胎牛血清(FBS)的RPMI-1640正常培養(yǎng)HUVECs，根據(jù)培養(yǎng)條件不同分為4組:(1)川崎病急性期血清組(KD1):HUVECs+川崎病急性期血清+ RPMI-1640培養(yǎng)基;(2)川崎病恢復(fù)期（丙種球蛋白治療后）

3、血清組(KD2):HUVECs+川崎病恢復(fù)期血清+RPMI-1640培養(yǎng)基;(3)正常血清組(N):HUVECs+正常兒童血清+RPMI-1640培養(yǎng)基(4)空白對(duì)照組(Con):HUVECs+ RPMI-1640培養(yǎng)基。
　　4.細(xì)胞增殖與凋亡的檢測(cè) CCK-8和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)各組血清對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的影響。
　　5.凋亡相關(guān)蛋白檢測(cè)各組干預(yù)因素加入細(xì)胞24h后應(yīng)用蛋白印跡技術(shù)(Western blot)檢測(cè)各組H

4、UVECs中凋亡相關(guān)基因Caspase-3蛋白的表達(dá)情況。
　　6.趨化因子及其受體基因表達(dá)水平的檢測(cè)各組干預(yù)因素加入細(xì)胞后24h后應(yīng)用qPCR熒光定量技術(shù)檢測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)趨化因子及其受體mRNA表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.應(yīng)用CCK-8法測(cè)定各組血清對(duì)HUVECs增殖的影響，發(fā)現(xiàn)KD1組、KD2和N組的OD值分別為（0.64±0.10、0.81±0.06、0.92±0.08），計(jì)算各組抑制率，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

5、P＜0.05)。
　　2.應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)KD1、KD2和N組的細(xì)胞總凋亡率，發(fā)現(xiàn)各組的凋亡率相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　3.含血清濃度為10％的各組誘導(dǎo)HUVECs時(shí)，KD1組和KD2組與N組相比，Caspase-3蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.05);而且KD2和N組比亦具有顯著性的差異(P＜0.05)。
　　4.趨化因子及其受體mRNA檢測(cè)結(jié)果:與KD1組相比，KD2組和N組的ADAM17 mR