SIRT1在高糖培養(yǎng)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用.pdf

1、目的： 近期發(fā)現(xiàn)長壽蛋白SIRT1可改善肥胖大鼠的胰島素敏感性，降低血糖，改善動脈粥樣硬化。但SIRT1改善糖尿病的機(jī)制未明，其是否參與了2型糖尿病及其大血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展尚缺乏深入的研究。本研究以高糖培養(yǎng)原代人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（HUVEC）為研究對象，研究SIRT1在其損傷中的作用及可能的機(jī)制。 方法： 0.25%胰蛋白酶灌注消化法分離HUVEC細(xì)胞。取生長良好的第2～3代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分4個(gè)部分。第1部分

2、：高糖對內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1表達(dá)及內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)的影響。培養(yǎng)細(xì)胞分為正常對照組（5.5 mmol/L葡萄糖）、高糖培養(yǎng)組（33.3mmol/L葡萄糖）、甘露醇高滲對照組（5.5 mmol/L葡萄糖+27.8 mmol/L露醇）。細(xì)胞處理48小時(shí)。應(yīng)用RT-PCR法檢測SIRT1、E-選擇素、eNOS、內(nèi)皮素-1基因的表達(dá)情況，以Western印跡法檢測培養(yǎng)細(xì)胞SIRT1的蛋白水平，以硝酸還原酶法檢測培養(yǎng)細(xì)胞上清中NO的含量。第2部分：S

3、IRT1激動劑白藜蘆醇對高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)的影響。細(xì)胞分為正常對照組、高糖組、1μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理24小時(shí)+高糖組。高糖處理48小時(shí)。分析指標(biāo)及方法同第一部分。第3部分：白藜蘆醇對SIRT1基因“沉默”后高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞功能指標(biāo)的影響。細(xì)胞分5組：正常對照組、高糖組、白藜蘆醇預(yù)處理+高糖組、SIRT1 siRNA+白藜蘆醇預(yù)處理+高糖組、Lipo2000+白藜蘆醇+高糖組（空載體組）。前3組細(xì)胞處理同第2部分。SIRT1

4、siRNA組細(xì)胞以Lipofectamine 2000脂質(zhì)體為載體轉(zhuǎn)染16.7 nmol/LSIRT1 siRNA入內(nèi)皮細(xì)胞，以干擾內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1的表達(dá)，干擾后6小時(shí)更換為正常培養(yǎng)液，24小時(shí)后進(jìn)行后續(xù)的白藜蘆醇和高糖處理?？蛰d體組單純以Lipofectamine2000脂質(zhì)體處理內(nèi)皮細(xì)胞，其余處理同SIRT1 siRNA組。分析指標(biāo)及方法同第一部分。第4部分：白藜蘆醇對高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的影響。培養(yǎng)細(xì)胞分為對照組、胰島素處

5、理組、高糖組+胰島素處理組、1μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理24小時(shí)+高糖+胰島素處理組。高糖處理48小時(shí)。后3組細(xì)胞以100 nmol/L胰島素刺激30 min。檢測上清中內(nèi)皮細(xì)胞NO分泌含量。 結(jié)果： （1）與正常對照相比，高糖培養(yǎng)48小時(shí)使內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1的mRNA及蛋白表達(dá)均降低（P<0.05）；內(nèi)皮細(xì)胞eNOS mRNA的表達(dá)及NO分泌降低（P<0.01）；而反映內(nèi)皮細(xì)胞損傷的因子如E-選擇素及內(nèi)皮素-1的表達(dá)卻

6、明顯升高（P<0.05）。甘露醇組與正常對照相比沒有顯著差異。 （2）與高糖組相比，1μmol/L白藜蘆醇預(yù)處理24小時(shí)明顯升高高糖處理內(nèi)皮細(xì)胞SIRT1的表達(dá)水平（P<0.01）；同時(shí)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS的表達(dá)（P<0.05）、NO分泌均明顯升高（P<0.01）；E-選擇素、內(nèi)皮素-1明顯降低（P<0.05）。 （3）與單純白藜蘆醇處理組相比，SIRT1 siRNA組細(xì)胞SIRT1的mRNA及蛋白水平均顯著降低（P<0.0

7、5），SIRT1蛋白表達(dá)的干擾效率為45.9%；內(nèi)皮細(xì)胞的eNOS表達(dá)、NO的分泌明顯降低（P<0.05），與高糖處理組沒有差異，提示隨SIRT1的表達(dá)“沉默”白藜蘆醇促進(jìn)eNOS表達(dá)、NO分泌的作用“消失”；內(nèi)皮素-1的表達(dá)沒有變化（P>0.05），均顯著低于高糖組，提示隨SIRT1的表達(dá)“沉默”白藜蘆醇對內(nèi)皮素-1的抑制作用不受影響；E-選擇素的表達(dá)明顯升高（P<0.05），與高糖處理組差異不明顯，提示隨SIRT1的表達(dá)“沉默”白藜

8、蘆醇對E-選擇素的抑制作用也“消失”?？蛰d體組與白藜蘆醇處理組相比各指標(biāo)無明顯差異。 （4）100 nmol/L胰島素處理30 min明顯刺激內(nèi)皮細(xì)胞NO的分泌。高糖使內(nèi)皮細(xì)胞胰島素刺激的NO分泌降低，產(chǎn)生了內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗。但是白藜蘆醇預(yù)處理可以明顯促進(jìn)高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞胰島素刺激的NO分泌。P均<0.01。 結(jié)論: （1）SIRT1通過促進(jìn)eNOS表達(dá)及刺激NO分泌而具有舒張血管的作用，還通過抑制E-選擇素的

9、表達(dá)降低白細(xì)胞對內(nèi)皮細(xì)胞的黏附。SIRT1的表達(dá)降低在高糖誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中具有重要作用，SIRT1激動劑可保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞不受高糖的影響，因而在預(yù)防和治療糖尿病大血管病變中具有廣闊的前景。 （2）白藜蘆醇可通過促進(jìn)SIRT1的表達(dá)而具有促進(jìn)高糖培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞eNOS表達(dá)、NO分泌及降低E-選擇素表達(dá)的作用。白藜蘆醇還具有抑制內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)皮素-1表達(dá)的作用，且該作用與SIRT1無關(guān)。白藜蘆醇還具有改善高糖環(huán)境下內(nèi)皮細(xì)胞胰島素抵抗的