PKCβ-p66Shc介導(dǎo)高水平尿素引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞ROS和炎癥的產(chǎn)生.pdf

1、心血管?。╟ardiovascular disease，CVDs）是終末期腎臟疾病(End Stage Renal Disease，ESRD)患者最常見(jiàn)的并發(fā)癥以及最主要的死亡原因，其致死率比其它并發(fā)癥高10～20倍[1]。而ESRD并發(fā)CVDs中又以動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）多見(jiàn)[2]。ESRD患者存在多種導(dǎo)致心血管疾病的危險(xiǎn)因素，如吸煙、高血壓、糖尿病、肥胖和血脂異常等，但這些傳統(tǒng)的危險(xiǎn)因素并不能完全解釋在

2、 ESRD患者并發(fā)CVDs特別是AS的高發(fā)性和較高的死亡率[3-6]，因此，研究AS的病理改變機(jī)制對(duì)于提高ESRD患者的生存和生活質(zhì)量十分重要。
　　氧化應(yīng)激作為重要危險(xiǎn)因素在CVDs特別是AS的發(fā)病機(jī)制中具有重要作用。血管壁ROS的大量產(chǎn)生不僅可導(dǎo)致一氧化氮（nitric oxide，NO）生物利用度降低而引起內(nèi)皮功能障礙，并且可損傷血管壁結(jié)構(gòu)而促進(jìn)AS的形成[7,8]。炎癥（inflammatory）在AS的形成中的重要作用也

3、不容忽視[9,10]。炎癥早期可募集免疫細(xì)胞至動(dòng)脈，晚期可激活動(dòng)脈壁的 T細(xì)胞產(chǎn)生并分泌炎性細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展[11]。有研究表明，高水平尿素可誘發(fā)脂肪細(xì)胞的氧化應(yīng)激和功能障礙，引發(fā)胰島素抵抗[12]。ESRD患者體內(nèi)的血尿素水平會(huì)隨著腎功能進(jìn)行性下降而不斷增高；高尿素水平是否為誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞活性氧簇（reactive oxygen species，ROS）大量產(chǎn)生以及促進(jìn)炎癥發(fā)生的重要病理因素，其機(jī)制如何？目前尚不清楚。<

4、br>　　銜接蛋白p66Shc是由原癌基因ShcA編碼、廣泛表達(dá)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)有調(diào)節(jié)線粒體功能的蛋白，介導(dǎo)了包括高血糖、同型半胱氨酸等多種病理因素所誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮功能失常[13]。而PKCβ是介導(dǎo)p66Shc蛋白磷酸化及其線粒體轉(zhuǎn)位的關(guān)鍵蛋白[14]，PKCβ/p66Shc/mCyt.C復(fù)合物的形成在PKCβ介導(dǎo)的細(xì)胞氧化損傷中起到關(guān)鍵作用[15]。我們?cè)谇捌诠ぷ髦邪l(fā)現(xiàn)高尿素可誘導(dǎo)p66Shc磷酸化水平的增高，那么，高尿素是否通過(guò)PK

5、Cβ/p66Shc通路誘導(dǎo)ROS的大量產(chǎn)生和炎癥的發(fā)生？因此，本研究擬采用體外實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證以上假設(shè)。
　　目的：
　　探討PKCβ/p66Shc通路在高水平尿素引起人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs）、ROS和炎癥產(chǎn)生中的作用。
　　方法：
　　體外培養(yǎng)HUVECs，分為正常對(duì)照組、甘露醇組、尿素組和尿素+PKCβ抑制劑(LY333531)組。

6、采用CCK-8法檢測(cè)高水平尿素對(duì)HUVECs活性的影響，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)的改變；DCFH-DA法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS含量；免疫熒光技術(shù)觀察細(xì)胞內(nèi)p-p66Shc、TNFα和ICAM-1的表達(dá)；Western blot檢測(cè)細(xì)胞中p66Shc、p-p66Shc、PKCβ、p-PKCβ、TNFα、ICAM-1、iNOS和eNOS的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：
　　1.25mmol/L尿素明顯抑制HUVECs活力，引起細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞

7、間隙增大，鋪路石樣排列結(jié)構(gòu)受到破壞等形態(tài)學(xué)改變。
　　2.與對(duì)照組相比，25 mmol/L尿素引起細(xì)胞內(nèi)ROS水平明顯升高，在6 h達(dá)到峰值（P＜0.05）；加入PKCβ抑制劑LY333531后ROS水平明顯降低（P＜0.05）。
　　3.25 mmol/L尿素負(fù)荷6 h后可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)p-p66Shc、TNFα和ICAM-1熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)；與此同時(shí)，尿素可誘導(dǎo)p-PKCβ、p-p66Shc、TNFα、ICAM-1和iNO

8、S蛋白的表達(dá)呈時(shí)間依賴性增加，其中p-p66Shc6 h組與對(duì)照組相比，升高了約76%（P＜0.01），24 h時(shí)升高了約2倍（P＜0.01）；p-PKCβ與對(duì)照組相比，24 h時(shí)升高了約64%（P＜0.05）。TNFα與對(duì)照組相比，6 h增加了約40%，24 h增加了約一倍（P＜0.05）；ICAM-1在6 h增加了約80%，24 h增加了約2倍（P＜0.05）；iNOS24 h升高了約1倍（P＜0.05）；eNOS與對(duì)照組相比，12

9、 h下降了約34%（圖7B，P＜0.05），24 h下降了約56%（P＜0.01）
　　4.加入LY333531后p-p66Shc、TNFα和ICAM-1熒光強(qiáng)度降低，同時(shí)，Western blot結(jié)果顯示，p-p66Shc、TNFα、ICAM-1蛋白表達(dá)下調(diào)，p-p66Shc蛋白的表達(dá)水平與對(duì)照組相比，降低了約40%（P＜0.05）；與6 h組相比，TNFα減少了約61%（P＜0.05）；ICAM-1減少了約94%（P＜0.01