高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡、NF-κB-iNOS-NO通路的影響及硫辛酸的干預(yù)作用.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM),是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病,主要病因是胰島素抵抗和胰島β細胞功能衰竭。長期慢性的血糖控制不良,以及隨之而來的高血脂、高血壓,可以導(dǎo)致心,眼,腎,足等多個臟器的并發(fā)癥,嚴重影響人們的生活質(zhì)量。氧化應(yīng)激信號通路激活會導(dǎo)致胰島素抵抗和胰島素分泌受損,氧化損傷主要由活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)和活性氮物質(zhì)(reactive nitro

2、gen species,RNS)所致,它們是細胞代謝過程中產(chǎn)生的含氧或含氮的活性產(chǎn)物,可通過脂質(zhì)過氧化等途徑誘導(dǎo)組織細胞損傷,具有重要的生理和病理意義。氧化應(yīng)激不僅也參與了2型糖尿病發(fā)病過程,而且構(gòu)成糖尿病晚期并發(fā)癥的發(fā)病機制。動脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ),氧化應(yīng)激亦在其中發(fā)揮重要的作用。英國的前瞻性研究表明,僅僅控制好血糖并不能有效的降低大血管并發(fā)癥的發(fā)病率,這提示我們,雖然血糖是造成糖尿病大血管病變的始動因素,但是不是唯

3、一因素,在大血管病變發(fā)展的過程中,還有別的因素參與進來。血糖升高會導(dǎo)致內(nèi)皮細胞功能不良,凋亡,內(nèi)皮完整性及保護作用遭到破壞,屏障作用消失,黏附分子表達增加,趨化因子釋放,白細胞黏附,巨噬細胞活化,平滑肌細胞遷移和增殖,最終形成動脈斑塊。NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子,參與了氧化應(yīng)激、多種炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。NF-κB可以激活多種免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因包括iNOS、白介素-1,6、干擾素、腫瘤壞死因子-α、血管細胞粘附分子-1和胞間粘附分子[1

4、]。NF-κB也可通過調(diào)整自身克隆基因和IκB的表達水平以達到自身調(diào)節(jié)的目的[2]。有學者認為NF-κB是動脈粥樣硬化發(fā)生的始動機理之一[3]。Linder等使用原位雜交和免疫組織技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),在小鼠內(nèi)皮細胞受損傷后45分鐘,在其受損的內(nèi)皮細胞核中NF-κB p65和p50蛋白亞體含量明顯較正常為高,3小時后經(jīng)Northern雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)VCAM-1mRNA及蛋白的表達增[4]。大量的實驗研究涉及到NFκB及其所誘導(dǎo)表達的細胞因子在方方

5、面面的應(yīng)用,本實驗就是體外觀察高糖對人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)凋亡及產(chǎn)生核因子-kappaB(NF-κB)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)的影響,探討NF-κB-iNOS-NO在糖尿病大血管病變發(fā)病機制中的作用,并應(yīng)用硫辛酸干預(yù),探討該藥的可能作用及機制。
　　 方法:
　　 體外培養(yǎng)HUVEC細胞,分為5組:(1)對照組(葡萄糖濃度:5.5mmol/L)(2)高糖組:(葡萄糖濃度:25mmol/L

6、)(3)高糖+硫辛酸(50μmaol/L)組(4)高糖+硫辛酸(100μmol/L)組(5)高糖+硫辛酸(200μmol/L)組,分別于0h,6h,12h,24h,48h留取樣本進行檢測。應(yīng)用流式細胞術(shù)測細胞凋亡,Western Blot測NF-κB的表達,比色法測iNOS,硝酸還原酶法測定NO。
　　 結(jié)果:
　　 1高糖組細胞凋亡率及上清液中iNOS、NO較對照組在6h、12h、24h、48h均顯著升高(P＜0.01

7、)。加入LA干預(yù),48h后,A1組的凋亡率及iNOS、NO表達量未見明顯下降,A2、A3組凋亡率及iNOS、NO均較高糖組下降(P＜0.01),差異具有統(tǒng)計學意義,呈現(xiàn)藥物劑量依賴性。
　　 2高糖組細胞核NF-κB蛋白的表達量隨著高糖作用時間的延長而明顯增加,而在給予硫辛酸干預(yù)后NF-κB蛋白的表達逐漸下降。
　　 結(jié)論:
　　 1高糖環(huán)境可導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細胞凋亡,NF-κB、iNOS、NO水平,顯著增加,提

8、示高糖可通過NF-κB-iNOS-NO通路對人臍靜脈內(nèi)皮細胞發(fā)揮作用,NF-κB-iNOS-NO通路可能與糖尿病大血管病變的發(fā)生有關(guān)。
　　 2 iNOS、NO在高糖作用早期(6h)就已表現(xiàn)出升高,提示其可能早期就參與了糖尿病大血管病變。
　　 3硫辛酸注射液能減少細胞凋亡,減輕NF-κB表達,遏制iNOS、NO的表達,從而改善內(nèi)皮細胞功能,減輕細胞損傷。提示硫辛酸可能通過NF-κB-iNOS-NO途徑減輕細胞損傷,從而