高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、NF-κB-iNOS-NO通路的影響及硫辛酸的干預(yù)作用.pdf

1、目的:糖尿病(diabetes mellitus,DM),是一組以慢性血糖水平增高為特征的代謝疾病,主要病因是胰島素抵抗和胰島β細(xì)胞功能衰竭。長(zhǎng)期慢性的血糖控制不良,以及隨之而來(lái)的高血脂、高血壓,可以導(dǎo)致心,眼,腎,足等多個(gè)臟器的并發(fā)癥,嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。氧化應(yīng)激信號(hào)通路激活會(huì)導(dǎo)致胰島素抵抗和胰島素分泌受損,氧化損傷主要由活性氧物質(zhì)(reactive oxygen species,ROS)和活性氮物質(zhì)(reactive nitro

2、gen species,RNS)所致,它們是細(xì)胞代謝過(guò)程中產(chǎn)生的含氧或含氮的活性產(chǎn)物,可通過(guò)脂質(zhì)過(guò)氧化等途徑誘導(dǎo)組織細(xì)胞損傷,具有重要的生理和病理意義。氧化應(yīng)激不僅也參與了2型糖尿病發(fā)病過(guò)程,而且構(gòu)成糖尿病晚期并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制。動(dòng)脈粥樣硬化是糖尿病大血管病變的病理基礎(chǔ),氧化應(yīng)激亦在其中發(fā)揮重要的作用。英國(guó)的前瞻性研究表明,僅僅控制好血糖并不能有效的降低大血管并發(fā)癥的發(fā)病率,這提示我們,雖然血糖是造成糖尿病大血管病變的始動(dòng)因素,但是不是唯

3、一因素,在大血管病變發(fā)展的過(guò)程中,還有別的因素參與進(jìn)來(lái)。血糖升高會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞功能不良,凋亡,內(nèi)皮完整性及保護(hù)作用遭到破壞,屏障作用消失,黏附分子表達(dá)增加,趨化因子釋放,白細(xì)胞黏附,巨噬細(xì)胞活化,平滑肌細(xì)胞遷移和增殖,最終形成動(dòng)脈斑塊。NF-κB為核轉(zhuǎn)錄因子,參與了氧化應(yīng)激、多種炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)。NF-κB可以激活多種免疫和炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因包括iNOS、白介素-1,6、干擾素、腫瘤壞死因子-α、血管細(xì)胞粘附分子-1和胞間粘附分子[1

4、]。NF-κB也可通過(guò)調(diào)整自身克隆基因和IκB的表達(dá)水平以達(dá)到自身調(diào)節(jié)的目的[2]。有學(xué)者認(rèn)為NF-κB是動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生的始動(dòng)機(jī)理之一[3]。Linder等使用原位雜交和免疫組織技術(shù)研究發(fā)現(xiàn),在小鼠內(nèi)皮細(xì)胞受損傷后45分鐘,在其受損的內(nèi)皮細(xì)胞核中NF-κB p65和p50蛋白亞體含量明顯較正常為高,3小時(shí)后經(jīng)Northern雜交技術(shù)發(fā)現(xiàn)VCAM-1mRNA及蛋白的表達(dá)增[4]。大量的實(shí)驗(yàn)研究涉及到NFκB及其所誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)胞因子在方方

5、面面的應(yīng)用,本實(shí)驗(yàn)就是體外觀察高糖對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)凋亡及產(chǎn)生核因子-kappaB(NF-κB)、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)及一氧化氮(NO)的影響,探討NF-κB-iNOS-NO在糖尿病大血管病變發(fā)病機(jī)制中的作用,并應(yīng)用硫辛酸干預(yù),探討該藥的可能作用及機(jī)制。
　　 方法:
　　 體外培養(yǎng)HUVEC細(xì)胞,分為5組:(1)對(duì)照組(葡萄糖濃度:5.5mmol/L)(2)高糖組:(葡萄糖濃度:25mmol/L

6、)(3)高糖+硫辛酸(50μmaol/L)組(4)高糖+硫辛酸(100μmol/L)組(5)高糖+硫辛酸(200μmol/L)組,分別于0h,6h,12h,24h,48h留取樣本進(jìn)行檢測(cè)。應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)細(xì)胞凋亡,Western Blot測(cè)NF-κB的表達(dá),比色法測(cè)iNOS,硝酸還原酶法測(cè)定NO。
　　 結(jié)果:
　　 1高糖組細(xì)胞凋亡率及上清液中iNOS、NO較對(duì)照組在6h、12h、24h、48h均顯著升高(P＜0.01

7、)。加入LA干預(yù),48h后,A1組的凋亡率及iNOS、NO表達(dá)量未見(jiàn)明顯下降,A2、A3組凋亡率及iNOS、NO均較高糖組下降(P＜0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,呈現(xiàn)藥物劑量依賴性。
　　 2高糖組細(xì)胞核NF-κB蛋白的表達(dá)量隨著高糖作用時(shí)間的延長(zhǎng)而明顯增加,而在給予硫辛酸干預(yù)后NF-κB蛋白的表達(dá)逐漸下降。
　　 結(jié)論:
　　 1高糖環(huán)境可導(dǎo)致人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,NF-κB、iNOS、NO水平,顯著增加,提

8、示高糖可通過(guò)NF-κB-iNOS-NO通路對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)揮作用,NF-κB-iNOS-NO通路可能與糖尿病大血管病變的發(fā)生有關(guān)。
　　 2 iNOS、NO在高糖作用早期(6h)就已表現(xiàn)出升高,提示其可能早期就參與了糖尿病大血管病變。
　　 3硫辛酸注射液能減少細(xì)胞凋亡,減輕NF-κB表達(dá),遏制iNOS、NO的表達(dá),從而改善內(nèi)皮細(xì)胞功能,減輕細(xì)胞損傷。提示硫辛酸可能通過(guò)NF-κB-iNOS-NO途徑減輕細(xì)胞損傷,從而