NADPH氧化酶調(diào)節(jié)TLR4介導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞增殖和炎癥表型的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景與目的：
　　心腦血管疾病嚴(yán)重危害著人類的身體健康,動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)作為其中最常見的一種血管病變,已成為基礎(chǔ)和臨床研究的焦點(diǎn)。AS被認(rèn)為是一種慢性炎癥性疾病,伴有免疫反應(yīng)的炎癥過程貫穿于其發(fā)生和發(fā)展的始終。而AS內(nèi)膜增生的形成與血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMC)的過度增殖并從中膜遷移到內(nèi)膜密切相關(guān)。在參與調(diào)節(jié)AS的諸多分子中,Toll樣受體4

2、(Toll-like receptor 4,TLR4)作為一種與免疫性和炎癥性疾病密切相關(guān)的模式識(shí)別受體,其介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在AS的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。當(dāng)血管受到損傷時(shí),位于血管中膜層的VSMC活化,并在TLR4的作用下大量增殖遷移至內(nèi)膜下,分泌多種炎癥因子(如IL-1、IL-6、IFN、MCP-1、TNF-α等),導(dǎo)致血管炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈內(nèi)膜增生,最終促進(jìn)AS的形成。
　　活性氧(reactive oxygen species,

3、ROS)是調(diào)節(jié)血管結(jié)構(gòu)和功能狀態(tài)的重要信號(hào)分子,ROS的蓄積可誘導(dǎo)炎癥因子的表達(dá),促進(jìn)AS的發(fā)生和發(fā)展。目前,還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate,NADPH)氧化酶被認(rèn)為是血管內(nèi)生成ROS的主要酶體,是維持血管細(xì)胞氧化還原狀態(tài)的一個(gè)重要決定因素。NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS可作為第二信使,激活細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,參與動(dòng)脈內(nèi)膜增生和血管炎癥反應(yīng),進(jìn)而影響

4、AS的發(fā)生和發(fā)展。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)NADPH氧化酶在TLR4的表達(dá)和活化中發(fā)揮著重要作用,但NADPH氧化酶是否通過TLR4參與調(diào)節(jié)VSMC的增殖遷移以及炎癥反應(yīng),進(jìn)而促進(jìn)動(dòng)脈內(nèi)膜增生和AS的發(fā)生發(fā)展目前尚不清楚。
　　有基于此,本研究擬深入探討TLR4介導(dǎo)的VSMC增殖遷移和炎癥表型在AS中的重要作用,以NADPH氧化酶為切入點(diǎn),分別采用NADPH氧化酶激動(dòng)劑血小板源性生長(zhǎng)因子BB(Platelet-derived growth

5、factor-BB,PDGF-BB)和抑制劑夾竹桃麻素(apocynin)使NADPH氧化酶過表達(dá)和表達(dá)抑制,探討NADPH氧化酶在TLR4介導(dǎo)的VSMC增殖遷移、炎癥反應(yīng)和動(dòng)脈內(nèi)膜增生中的作用,為深入研究AS形成的機(jī)制提供新思路,為尋找防治AS的新靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。
　　材料與方法:
　　在體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部分:采用非顯微外科手術(shù)方法,建立wire誘導(dǎo)的小鼠頸動(dòng)脈損傷模型。根據(jù)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物來(lái)源及干預(yù)措施的不同,分別分為:C57BL/

6、6J小鼠:①假手術(shù)組,②手術(shù)組(手術(shù)損傷左側(cè)頸總動(dòng)脈),③手術(shù)+NADPH氧化酶抑制劑組(手術(shù)+apocynin灌胃200mg/kg.d);TLR4基因敲除(TLR4-/-)小鼠:①假手術(shù)組,②手術(shù)組(手術(shù)損傷左側(cè)頸總動(dòng)脈),③手術(shù)+NADPH氧化酶抑制劑組(手術(shù)+apocynin灌胃200mg/kg.d)。在小鼠頸動(dòng)脈損傷后14天,分別取各組小鼠損傷側(cè)頸總動(dòng)脈,采用HE染色方法在顯微鏡下觀察新生內(nèi)膜增生情況并計(jì)算內(nèi)膜/中膜的比值;采用

7、Western blot方法檢測(cè)損傷動(dòng)脈TLR4蛋白的表達(dá)情況。在小鼠頸動(dòng)脈損傷后14天,分別采集各組小鼠外周血液,采用ELISA方法測(cè)定炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平。
　　離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)部分:采用組織貼塊法培養(yǎng)C57和TLR4-/-小鼠胸主動(dòng)脈VSMCs,倒置相差顯微鏡下觀察C57及TLR4-/-VSMCs生長(zhǎng)形態(tài),并通過α-SMA免疫熒光染色鑒定所培養(yǎng)的VSMCs,選取生長(zhǎng)良好的3-6代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。根據(jù)細(xì)

8、胞來(lái)源及干預(yù)措施的不同分為:C57-VSMCs:①對(duì)照組(加入等體積的PBS溶液);②PDGF-BB處理組(加20ug/LPDGF-BB,37℃5％CO2培養(yǎng)24h);③Apocynin處理組(加100umol/Lapocynin預(yù)處理1h后再加20ug/LPDGF-BB,37℃5%CO2培養(yǎng)24h)。TLR4-/--VSMCs:①對(duì)照組(加入等體積的PBS溶液);②PDGF-BB處理組(加20ug/LPDGF-BB,37℃5%CO2培

9、養(yǎng)24h);③Apocynin處理組(加100umol/Lapocynin預(yù)處理1h后再加20ug/LPDGF-BB,37℃5%CO2培養(yǎng)24h)。干預(yù)結(jié)束后分別收集各干預(yù)組細(xì)胞,采用DCFH-DA處理細(xì)胞并使用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)VSMCs中ROS的產(chǎn)生情況;采用Western blot方法檢測(cè)VSMCs中TLR4蛋白的表達(dá)情況;采用MTT染色法及改良Boyden小室法檢測(cè)VSMCs的增殖和遷移情況。干預(yù)結(jié)束后分別收集各干預(yù)組細(xì)胞上清,采用

10、ELISA方法測(cè)定炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)的水平。
　　結(jié)果:
　　1.C57小鼠頸動(dòng)脈損傷后動(dòng)脈內(nèi)膜明顯增生,內(nèi)膜/中膜的比值顯著增高,且損傷血管局部TLR4蛋白及外周血炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)水平升高。而TLR4-/-可顯著抑制頸動(dòng)脈損傷后動(dòng)脈內(nèi)膜增生及外周血炎癥因子水平。表明TLR4參與調(diào)控頸動(dòng)脈損傷后動(dòng)脈內(nèi)膜增生及炎癥反應(yīng)過程。
　　2.與C57小鼠手術(shù)組相比,頸動(dòng)脈損傷

11、后加用NADPH氧化酶抑制劑apocynin可明顯抑制頸動(dòng)脈內(nèi)膜增生、損傷血管局部TLR4蛋白表達(dá)以及外周血IL-6、IL-1β和TNF-α水平。而TLR4-/-小鼠加用apocynin后頸總動(dòng)脈內(nèi)膜增生及炎癥因子水平未受到明顯抑制。表明NADPH氧化酶參與調(diào)節(jié)血管損傷后TLR4介導(dǎo)的新生內(nèi)膜形成及炎癥反應(yīng)過程。
　　3.C57-VSMCs經(jīng)NADPH氧化酶激動(dòng)劑PDGF-BB刺激后,VMSCs增殖遷移能力增強(qiáng)、TLR4蛋白及炎癥

12、因子表達(dá)水平明顯增加。而TLR4-/-可顯著抑制VSMCs增殖遷移及炎癥因子的表達(dá)。表明TLR4在VSMC增殖遷移及炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
　　4.C57-VSMCs經(jīng)NADPH氧化酶激動(dòng)劑PDGF-BB刺激后,VSMCs內(nèi)ROS的產(chǎn)生明顯增加,而NADPH氧化酶抑制劑apocynin可明顯抑制PDGF-BB誘導(dǎo)的VSMCs內(nèi)ROS生成。且TLR4-/--VSMCs各組間ROS的變化趨勢(shì)與C57-VSMCs一致。結(jié)合PDG

13、F-BB在促進(jìn)TLR4蛋白表達(dá)中的作用,提示NADPH氧化酶衍生的ROS參與調(diào)節(jié)TLR4蛋白的表達(dá)。
　　5.采用NADPH氧化酶抑制劑apocynin下調(diào)NADPH氧化酶活性,抑制ROS產(chǎn)生,可明顯抑制C57-VSMCs增殖遷移以及TLR4蛋白和炎癥因子(IL-6、IL-1β和TNF-α)表達(dá)。而TLR4-/--VSMCs加用apocynin后增殖遷移及炎癥因子水平未受到明顯抑制。表明NADPH氧化酶衍生的ROS參與調(diào)節(jié)TLR4