血管緊張素Ⅱ促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的機(jī)制研究.pdf

1、本課題共分為三個(gè)部分
　　 第一部分：小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的模型建立
　　 研究目的：深入了解血管平滑肌細(xì)胞(VSMCs)發(fā)育及分化的特點(diǎn)對(duì)于了解血管疾病的過(guò)程非常重要。然而，目前對(duì)VSMCs特異分化及終末分化誘因的研究非常有限，原因之一是缺乏一種合適的VSMCs發(fā)育模型。胚胎干細(xì)胞為早期VSMCs的譜系形成、分化及成熟機(jī)制的研究提供了一種有價(jià)值的體外模型，而從胚胎干細(xì)胞單一、定向分化成為血管平滑肌細(xì)

2、胞為將來(lái)的進(jìn)一步研究其分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 研究方法：將充滿活力的小鼠胚胎干細(xì)胞D3系種植于Ⅳ型膠原包被的培養(yǎng)皿/板上，經(jīng)過(guò)8天的誘導(dǎo)分化，取其中的2、4、6、8天各個(gè)點(diǎn)的細(xì)胞進(jìn)行熒光定量PCR及免疫印跡試驗(yàn)，驗(yàn)證其平滑肌標(biāo)志基因SMA、SM22、calponin、SM-MHC的表達(dá)水平。
　　 研究結(jié)果：Ⅳ型膠原成功誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞定向分化成為平滑肌細(xì)胞，平滑肌標(biāo)志基因及蛋白可隨誘導(dǎo)時(shí)間的增加而同步增加，最高峰在第8

3、天。
　　 結(jié)論：利用Ⅳ型膠原的誘導(dǎo)分化，成功建立起胚胎干細(xì)胞單一、定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的體外模型，為進(jìn)一步探討其分化機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　 第二部分：血管緊張素Ⅱ促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞
　　 研究目的：體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均發(fā)現(xiàn)血管緊張素Ⅱ不僅僅是一個(gè)體液調(diào)節(jié)因子，它還是一種促血管新生的因子，可以刺激成血管細(xì)胞，包括內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞的生長(zhǎng)、發(fā)育、分化及凋亡。本實(shí)驗(yàn)旨在探明AngⅡ在胚胎干細(xì)胞

4、分化成為血管平滑肌細(xì)胞過(guò)程中本身所具有的生理作用。
　　 研究方法：采用在Ⅳ型膠原誘導(dǎo)分化過(guò)程中最有分化變化的第四天的干細(xì)胞，加入不同濃度的AngⅡ刺激(10-6-10-14mol/L)48小時(shí)后檢測(cè)平滑肌標(biāo)志基因SMA、SM22、calponin、SM-MHC的基因及蛋白表達(dá)水平。同時(shí)對(duì)AngⅡ10-9mol/L組及對(duì)照組進(jìn)行免疫熒光的染色比較。此外還分析了AngⅡ(10-6-10-10mol/L)的刺激是否與促進(jìn)細(xì)胞增殖相關(guān)

5、的MTT研究。
　　 研究結(jié)果：AngⅡ可以濃度依賴性的刺激上述標(biāo)志基因的改變，在mRNA水平SMA、SM22、calponin及SM-MHC的刺激最高峰處在10-9mol/L(p<0.01)，而在蛋白水平SMA、SM22及calponin的峰值在10-9mol/L(p<0.01)。同時(shí)免疫熒光染色也顯示出增強(qiáng)的標(biāo)志基因SMA、SM22、calponin的熒光強(qiáng)度，但是SM-MHC的熒光改變不明顯。此外AngⅡ不同濃度刺激下細(xì)胞

6、增殖并未發(fā)生明顯改變。
　　 結(jié)論：AngⅡ可以濃度依賴性的刺激平滑肌標(biāo)志基因的表達(dá)，從而可以促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化成為血管平滑肌細(xì)胞，此促進(jìn)分化的過(guò)程與促進(jìn)細(xì)胞增殖無(wú)關(guān)。
　　 第三部分：血管緊張素Ⅱ促進(jìn)小鼠胚胎干細(xì)胞定向分化成為血管平滑肌細(xì)胞的機(jī)制探討
　　 研究目地：本部分通過(guò)對(duì)AngⅡ細(xì)胞外信號(hào)通路的探索，重點(diǎn)研究其促進(jìn)分化過(guò)程中的主要參與部分，包括血管緊張素Ⅱ的受體及磷脂酰肌醇3激酶PI3K/Akt信號(hào)通路

7、，同時(shí)探討AngⅡ在轉(zhuǎn)錄因子水平對(duì)分化調(diào)控的可能參與因子。
　　 研究方法：Ⅳ型膠原誘導(dǎo)分化第四天的胚胎干細(xì)胞中，預(yù)先加入AngⅡⅠ型受體(AT1R)阻斷劑氯沙坦(losartan)、AngⅡⅡ型受體(AT2R)阻斷劑PD123319，及NF-κB抑制劑BAY11-7082，后給予AngⅡ10-9mol/L的刺激，檢測(cè)平滑肌標(biāo)志基因蛋白SMA及calponin的改變。PI3K/Akt信號(hào)通路研究上，主要通過(guò)AngⅡ不同濃度(10

8、-6-10-10mol/L)刺激下檢測(cè)相關(guān)的PI3K下游磷酸化Akt的變化；同時(shí)分析PI3K阻斷劑LY294002作用下平滑肌標(biāo)志基因蛋白SMA和calponin及磷酸化Akt的改變。此外在轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)AngⅡ不同濃度(10-6-10-10mol/L)對(duì)平滑肌標(biāo)志基因SMA及SM22啟動(dòng)子活性的影響，及對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子NF-KappaB(NF-κBp50,p65)，c-Jun等的作用。關(guān)于AngⅡ促進(jìn)分化是否涉及炎癥相關(guān)基因蛋白的表達(dá)的驗(yàn)

9、證，是通過(guò)檢測(cè)AngⅡ刺激下(10-6-10-10mol/L)兩個(gè)炎癥相關(guān)蛋白TNF-a及c-fos的表達(dá)來(lái)進(jìn)行。
　　 研究結(jié)果：AngⅡ(10-9mol/L)的促進(jìn)平滑肌標(biāo)志基因SMA和calponin表達(dá)的作用可以被AngⅡⅠ型受體阻斷劑losartan所阻斷，而非AngⅡⅡ型受體阻斷劑PD123319。AngⅡ濃度依賴性的促進(jìn)磷酸化Akt的表達(dá)，在AngⅡ10-9mol/L(p<0.01)刺激下達(dá)最高峰。PI3K抑制劑L

10、Y294002可以阻斷AngⅡ刺激的平滑肌標(biāo)志基因的上調(diào)，同時(shí)也可以阻斷磷酸化Akt的表達(dá)，但是兩組阻斷劑效果不盡相同，AngⅡ刺激組較之對(duì)照組仍然有相對(duì)高表達(dá)的平滑肌標(biāo)志基因及磷酸化Akt表達(dá)水平。此外AngⅡ可以在適當(dāng)濃度(10-8-10-9mol/L)刺激平滑肌標(biāo)志基因SMA啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性，同時(shí)可以濃度依賴性的刺激NF-κBp50的表達(dá)，最高刺激濃度為10-9mol/L(p<0.01)，而NF-κB抑制劑BAY11-7082則可

11、抑制AngⅡ(10-9mol/L)的促進(jìn)平滑肌標(biāo)志基因SMA和calponin表達(dá)的作用(p<0.01)。PI3K抑制劑LY294002可以阻斷NF-κBp50的高表達(dá)，但是AngⅡ刺激組(10-9mol/L)較之對(duì)照組仍顯示出相對(duì)高的表達(dá)活性。不同濃度的AngⅡ的刺激并未顯著上調(diào)炎癥相關(guān)因子TNF-a及c-fos的表達(dá)。
　　 結(jié)論：AngⅡ主要通過(guò)AT1受體參與促進(jìn)胚胎干細(xì)胞分化成為血管平滑肌細(xì)胞的過(guò)程。AngⅡ雖然主要是通