胚胎干細(xì)胞體外分化成造血前體細(xì)胞和骨骼肌細(xì)胞的研究.pdf

1、第一部分:胚胎于細(xì)胞體外分化成造血前體細(xì)胞的研究;目的:用小鼠ES細(xì)胞作為研究材料,在體外培養(yǎng)條件下加入外源細(xì)胞因子的不同組合,啟動(dòng)ES細(xì)胞向CD34<'+>造血前體細(xì)胞分化,為尋找影響成血發(fā)育早期階段的細(xì)胞因子和培養(yǎng)條件提供實(shí)驗(yàn)資料.方法:我們選用甲基纖維素半固體培養(yǎng)系統(tǒng),采用EBs分化誘導(dǎo)法,加入不同的外源的細(xì)胞因子的組合,啟動(dòng)小鼠ES細(xì)胞向造血細(xì)胞分化.以CD34<'+>細(xì)胞作為造血前體細(xì)胞的標(biāo)志,用流式細(xì)胞計(jì)術(shù)檢測(cè)了一組造血細(xì)胞

2、因子BMP4、bFGF、SCF、Tpo、VEGF等的不同組合生成CD34<'+>細(xì)胞的比例,分析這些細(xì)胞因子在成血發(fā)育早期階段的作用.結(jié)論:在ES細(xì)胞體外分化成CD34<'+>造血前體細(xì)胞過(guò)程中,細(xì)胞因子BMP4和/或bFGF作用于ES細(xì)胞成血分化的最早期階段,是早期作用因子.相比較而言,VEGF作用于ES細(xì)胞成血分化的較后期階段,是一個(gè)后期作用因子.第一、二階段加入BMP4、VEGF的順序組合與第二階段加入Tpo、VEGF組合均能較有

3、效的誘導(dǎo)ES細(xì)胞生成CD34<'+>造血前體細(xì)胞.第二部分:胚胎干細(xì)胞體外分化成的造血前體細(xì)胞移植入小鼠體內(nèi)的研究;目的:用8組不同組合的外源細(xì)胞因子將ES細(xì)胞在體外進(jìn)行成血分化誘導(dǎo)并移植入小鼠體內(nèi),觀察哪組細(xì)胞因子組合能有效誘導(dǎo)ES細(xì)胞生成有長(zhǎng)期造血功能的造血前體細(xì)胞.為探索ES細(xì)胞來(lái)源的造血干細(xì)胞移植應(yīng)用于臨床提供實(shí)驗(yàn)資料.方法:采用第一部分的ES細(xì)胞體外分化體系.采用甲基纖維素半固體培養(yǎng)系統(tǒng)和EBs分化誘導(dǎo)法,在培養(yǎng)體系中加入8組

4、不同組合的外源的細(xì)胞因子,將ES細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成造血前體細(xì)胞,并將這8組分化細(xì)胞分別移植入輻射照射的BALB/c小鼠體內(nèi)去觀察其功能.在細(xì)胞移植后10天取8組移植細(xì)胞的受體小鼠的各種器官,冰凍切片,X-gal染色觀察來(lái)源于ES細(xì)胞的移植細(xì)胞是否歸巢及是否存在組織非特異性分布現(xiàn)象.結(jié)論:細(xì)胞因子BMP4、VEGF的順序組合能誘導(dǎo)ES細(xì)胞生成有長(zhǎng)期造血能力的造血前體細(xì)胞,移植后能長(zhǎng)期植入受體小鼠體內(nèi),形成低程度的嵌合狀態(tài).第三部分:體外

5、誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為骨骼肌細(xì)胞的研究;目的:用RA作為誘導(dǎo)劑將ES細(xì)胞在體外誘導(dǎo)分化成骨骼肌細(xì)胞,為深入探討骨骼肌細(xì)胞的發(fā)育提供實(shí)驗(yàn)資料.方法:選用液體培養(yǎng)系統(tǒng),先讓ES細(xì)胞不貼壁懸浮生長(zhǎng)形成EBs,再將生長(zhǎng)5天的EB種入細(xì)胞培養(yǎng)皿中使其貼壁生長(zhǎng).結(jié)論:通過(guò)給予ES細(xì)胞適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)條件,5×10<'-7>M濃度的RA作為誘導(dǎo)劑能有效地將ES細(xì)胞誘導(dǎo)分化成骨骼肌細(xì)胞.第四部分:胚胎干細(xì)胞來(lái)源的骨骼肌細(xì)胞橫向分化成血細(xì)胞的研究;目的:將ES細(xì)

6、胞體外分化成的骨骼肌細(xì)胞移植入輻射照射后的小鼠體內(nèi),觀察ES細(xì)胞來(lái)源的骨骼肌細(xì)胞是否能橫向分化成血細(xì)胞.方法:將ES細(xì)胞體外分化成的骨骼肌細(xì)胞分別移植入BALB/c小鼠和C57BL/6小鼠這兩種MHC I型不同的輻射照射后的受體小鼠體內(nèi),對(duì)兩種受體小鼠進(jìn)行長(zhǎng)期存活觀察.取長(zhǎng)期存活的BALB/c受體小鼠,通過(guò)PCR檢測(cè)其外周血中是否有移植細(xì)胞攜帶的Lac-Z報(bào)告基因,流式細(xì)胞儀檢測(cè)其胸腺、脾臟、骨髓、外周血中ES細(xì)胞來(lái)源的細(xì)胞所占的比例來(lái)