新西蘭兔羊水間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)及體外聯(lián)合誘導(dǎo)向心肌樣細(xì)胞分化的研究.pdf

1、背景與目的：羊水干細(xì)胞具有接近全能干細(xì)胞的分化潛能，增值速度快，無致瘤性，免疫原性低，且取材方便，方法簡(jiǎn)單安全，不涉及倫理問題，已逐漸成為干細(xì)胞來源的研究熱點(diǎn)。作為新型的種子細(xì)胞，羊水干細(xì)胞已用于治療心血管疾病的研究中。多項(xiàng)研究結(jié)果表明，羊水干細(xì)胞可以分化為心肌樣細(xì)胞，但是轉(zhuǎn)化的比例和數(shù)量有限，如何提高向心肌細(xì)胞分化的效能是心血管干細(xì)胞治療迫切需要解決的問題之一。本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)從新西蘭兔中提取培養(yǎng)出羊水間充質(zhì)干細(xì)胞(amniotic flu

2、id mesechymal stem cells，AF-MSCs)，通過5-氮胞苷(5-Azacytidine，5-Aza)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(transforming growth factor-β1，TGF-β1)單獨(dú)及聯(lián)合應(yīng)用，體外誘導(dǎo)AF-MSCs向心肌樣細(xì)胞分化。研究兔AF-MSCs的成功培養(yǎng)條件和體外分化為心肌樣細(xì)胞的能力，以及通過對(duì)誘導(dǎo)分化的細(xì)胞進(jìn)行心肌細(xì)胞的特異蛋白檢測(cè)來比較5-Aza、TGF-β1的聯(lián)合誘導(dǎo)與各自單獨(dú)誘導(dǎo)的

3、效果。為干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化尋找更高效的誘導(dǎo)方法，為心血管疾病的干細(xì)胞治療奠定一定基礎(chǔ)。
　　方法：(1)收集孕新西蘭兔羊水進(jìn)行培養(yǎng)。取90％融合的P3兔AF-MSCs，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)其表面抗體CD29、CD44和CD34，用Cell Quest軟件進(jìn)行分析；采用Western Blot法和免疫熒光法檢測(cè)全能干細(xì)胞特異性蛋白OCT-4。
　　(2)AF-MSCs在體外定向誘導(dǎo)分為四組：5-Aza與TGF-β1聯(lián)合誘導(dǎo)組、

4、5-Aza單獨(dú)誘導(dǎo)組、TGF-β1單獨(dú)誘導(dǎo)組和空白對(duì)照組。取第3代生長(zhǎng)狀態(tài)良好的AF-MSCs進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)條件下藥物誘導(dǎo)。分別于誘導(dǎo)3、4周用Western Blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞特異性蛋白cTnT、Connexin43來比較向心肌樣細(xì)胞分化的程度，用Image J分析軟件進(jìn)行灰度分析，用SPSS16.0對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。
　　結(jié)果：(1)兔羊水中可分離培養(yǎng)出間充質(zhì)干細(xì)胞，其表面標(biāo)記CD29、CD44陽性表達(dá)，CD34陰性表達(dá)；OC

5、T-4陽性。
　　(2)AF-MSCs分別經(jīng)5-Aza、TGF-β1及二者聯(lián)合體外誘導(dǎo)可向心肌樣細(xì)胞分化。5-Aza與TGF-β1聯(lián)合誘導(dǎo)組在誘導(dǎo)21天和28天時(shí)特異性蛋白cTnT和間隙連接蛋白Connexin43含量表達(dá)較5-Aza單獨(dú)誘導(dǎo)組及TGF-β1單獨(dú)誘導(dǎo)組均高(P<0.05)；經(jīng)5-Aza體外誘導(dǎo)的AF-MSCs在誘導(dǎo)21天后向心肌樣細(xì)胞分化不明顯，誘導(dǎo)28天時(shí)分化明顯；經(jīng)TGF-β1體外誘導(dǎo)的AF-MSCs在誘導(dǎo)21