Akt在Islet-1促C3H10T1-2向心肌樣細胞特化過程中的作用探討.pdf

1、目的：
　　用攜帶Islet-1的慢病毒感染間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2并誘導其向心肌細胞特異分化。在此條件下，通過影響Akt的活性，檢測心肌早期發(fā)育相關基因的變化情況，來探討Akt在此特化過程中是否發(fā)揮促分化的作用及機制。
　　方法：
　　1.取生長狀態(tài)以及形態(tài)良好的間充質(zhì)干細胞C3H10T1/2以5×104個/T13的密度進行細胞鋪瓶，待增殖融合度達到60-70﹪時，向瓶中添加帶有GFP和Islet-1的慢病毒感

2、染細胞。待慢病毒感染細胞特定時間后，利用流式細胞術對感染細胞的病毒轉(zhuǎn)染效率進行檢測；細胞免疫熒光對Islet-1，cTnT和p-Akt/T-Akt蛋白的定位和表達進行檢測以及采用Western-bloting對這些蛋白進行半定量測定。
　　2.Akt特異性抑制劑 MK-2206處理 Islet-1慢病毒感染后的細胞,CCK-8法檢測其對病毒感染后細胞增殖的影響以及采用Western-bloting對細胞Akt活性進行檢測；實時熒光

3、定量PCR對各組細胞心肌特異轉(zhuǎn)錄因子（Mef2c,Nkx2.5和GATA4）的mRNA時序性表達情況進行檢測。
　　結果：
　　1.經(jīng)慢病毒感染的C3H10T1/2細胞培養(yǎng)96h后，可在鏡下觀察到穩(wěn)定表達GFP的細胞約為90％，F(xiàn)CM對陰性和實驗組細胞病毒轉(zhuǎn)染效率的檢測結果分別為89.7％和94.7％。免疫熒光和Western-bloting均檢測到感染后細胞Islet-1和cTnT蛋白的表達。
　　2.CCK-8結果

4、表明，MK-2206的濃度與其對細胞的生長抑制程度呈正相關；Western-bloting結果顯示，其對感染后細胞Akt活性的最佳抑制濃度為8nmol/L；隨著誘導分化時間的延長，感染后細胞的p-Akt/T-Akt蛋白表達逐漸降低，且在第3周最低（*P＜0.05），而后開始升高；Q-PCR檢測到心肌特異基因Mef2c,Nkx2.5和GATA4的mRNA表達量出現(xiàn)逐漸升高的趨勢（*P＜0.05），說明干細胞向心肌樣細胞特異分化；經(jīng)MK-2