白藜蘆醇對H2O2誘導人臍靜脈內皮細胞損傷的深度相關性調節(jié)作用.pdf

1、目的：
　　 本研究通過分離培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(human umbilical veinendothelial cells,HUVECs),建立H2O2氧化損傷模型,觀察白藜蘆醇(resveratrol,Res)對H2O2誘導HUVECs損傷的影響。
　　 方法：
　　 采用膠原酶灌注法分離培養(yǎng)HUVECs,根據形態(tài)學特征及Ⅷ因子免疫熒光法鑒定細胞;建立H2O2氧化損傷模型;檢測細胞內超氧化物歧化酶(super

2、oxide dismutase,SOD)活力和谷胱甘肽(glutathion,GSH)含量;Hoechst33258染色及Annexin-V/PI雙染流式細胞儀檢測HUVECs凋亡;JC-1檢測線粒體膜電位變化。
　　 結果：
　　 一、HUVECs鑒定
　　 在倒置相差顯微鏡下觀察,分離培養(yǎng)的細胞呈典型鋪路石樣;免疫熒光標記法檢測到細胞內有Ⅷ因子相關抗原的表達,表明所分離的細胞為HUVECs來源。
　　

3、 二、H2O2對HUVECs細胞活力的影響
　　 結果：顯示100μmol/L H2O2和200μmol/L H2O2顯著降低HUVECs細胞活力(P＜0.05或P＜0.001)。
　　 三、低濃度Res(0.5-10μmol/L)對H2O2誘導HUVECs氧化損傷的保護作用
　　 1.低濃度Res(0.5-10μmol/L)對HUVECs細胞活力降低的保護作用100μmol/L H2O2作用于HUVECs30

4、min后,細胞活力顯著下降(與正常對照組比較,P＜0.001);Res(0.5、1、10μmol/L)干預后,細胞活力呈劑量依賴性升高,與H2O2組比較,10μmol/L Res組差異顯著(P＜0.001)。
　　 2.低濃度Res(0.5-10μmol/L)對HUVECs細胞內SOD活力及GSH含量的影響
　　 100μmol/L H2O2作用于HUVECs30min后,HUVECs細胞內SOD活力從正常對照組的(28

5、.2±0.7)U/mg prot下降為(14.6±1.5)U/mg prot,差異顯著(P＜0.001);HUVECs細胞內GSH含量從正常對照組的(63.4±8.1)mg/g prot下降至(27.3±1.5)mg/g prot,差異顯著(P＜0.001)。0.5、1、10μmol/L Res分別使細胞內SOD活力升高至(15.6±2.5)U/mg prot、(16.4±1.6)U/mg prot、(19.1±1.9)U/mg pro

6、t,與H2O2組比較,10μmol/L Res組差異顯著(P＜0.01);分別使細胞內GSH含量升至(28.7±4.8)mg/g prot、(33.4±10.7)mg/g prot、(40.3±3.9)mg/g prot,與H2O2組比較,10μmol/L Res組差異顯著(P＜0.01)。
　　 3.低濃度Res(0.5-10μmol/L)對HUVECs凋亡的影響
　　 Hoechst33258染色后,正常對照組細胞核

7、形態(tài)均一,呈均勻深藍色熒光,H2O2作用后,細胞核著色不均勻,呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學變化。Res(0.5、1、10μmol/L)作用后,隨藥物濃度的增加,細胞凋亡形態(tài)逐漸改善,10μmol/L Res作用更明顯,細胞核呈現(xiàn)均勻藍色熒光。
　　 Annexin-V/PI雙染流式細胞儀檢測,100μmol/L H2O2作用HUVECs30 min后,細胞凋亡率由正常對照組的(12.5±0.4)％升至(24.3±2.2)％,差異顯著(P＜

8、0.01):0.5、1、10μmol/L Res可降低HUVECs凋亡率,分別為(20.4±2.7)％、(19.1±3.1)％和(15.9±4.6)％,與H2O2組比較,10μmol/L Res組差異顯著(P＜0.05)。
　　 4.低濃度Res(0.5-10μmol/L)對HUVECs線粒體膜電位的影響
　　 JC-1染色后,正常對照組HUVECs呈紅色熒光。HUVECs經100μmol/L H2O2作用后,以綠色熒光

9、為主,紅色熒光顯著減少。Res可劑量依賴性增加紅色熒光,10μmol/L Res作用最顯著。
　　 四、高濃度(13.75-55μmol/L)Res對H2O2誘導HUVECs凋亡的影響
　　 1.高濃度Res(13.75-55μmol/L)對H2O2誘導HUVECs細胞活力降低的影響
　　 200μmol/L H2O2作用2h后,HUVECs細胞活力明顯下降,與正常對照組比較,差異顯著(P＜0.001)。Res預

10、處理后,13.75μmol/L組HUVECs細胞活力升高,與H2O2組比較差異顯著(P＜0.05),27.5、55μmol/L Res對HUVECs細胞活力無顯著影響。
　　 2.高濃度Res(13.75-55μmol/L)對HUVECs細胞內SOD活力和GSH含量的影響
　　 200μmol/L H2O2作用2h后,HUVECs細胞內SOD活力從正常對照組的(27.5±8.5)U/mg prot下降為(18.7±4.0

11、)U/mg prot,差異顯著(P＜0.05);HUVECs細胞內GSH含量從正常對照組的(59.2±1.5)mg/g prot下降至(47.0±2.3)mg/g prot,差異顯著(P＜0.05)。Res(13.75、27.5、55μmol/L)對細胞內SOD活力無明顯影響。13.75μmol/LRes使細胞內GSH含量升至(58.2±6.1)mg/g prot(與H2O2組比較,P＜0.05),27.5、55μmol/L Res對細

12、胞內GSH含量無明顯影響。3.高濃度Res(13.75-55μmol/L)對HUVECs凋亡的影響
　　 Hoechst33258染色,在熒光顯微鏡下觀察凋亡形態(tài)學變化。正常HUVECs細胞核呈均勻深藍色熒光,形態(tài)較均一;用200μmol/L H2O2處理后,HUVECs細胞核著色不均勻,呈現(xiàn)典型凋亡形態(tài)學變化;13.75μmol/L Res可改善HUVECs凋亡形態(tài)學變化,27.5、55μmol/L Res組無明顯改善。

13、>　　 Annexin-V/PI雙染流式細胞儀檢測HUVECs凋亡率變化。200μmol/L H2O2處理HUVECs2h后,細胞凋亡率由正常對照組的(10.4±1.9)％升至(28.3±3.5)％,差異顯著(P＜0.01);13.75、27.5、55μmol/L Res組的細胞凋亡率分別為(18.2±5.2)％、(29.0±2.8)％和(36.2±2.9)％,13.75μmol/L Res顯著降低細胞凋亡率(與H2O2組比較,P＜0

14、.05),55μmol/L Res顯著升高細胞凋亡率(與H2O2組比較,P＜0.05)。
　　 4.高濃度Res(13.75-55μmol/L)對HUVECs線粒體膜電位的影響
　　 JC-1染色后,正常對照組HUVECs呈紅色熒光。經200μmol/LH2O2處理后,HUVECs以綠色熒光為主,紅色熒光顯著減少。13.75μmol/L Res組HUVECs綠色熒光減少,紅色熒光增多;55μmol/L Res組紅色熒光恢

15、復不明顯。
　　 結論：
　　 1.H2O2可誘導HUVECs細胞損傷,可能與降低抗氧化能力及細胞內線粒體膜電位有關。
　　 2.低濃度Res(10μmol/L)對H2O2誘導HUVECs氧化損傷具有保護作用,可能與增強抗氧化能力、抑制線粒體膜電位下降有關。
　　 3.高濃度Res(55μmol/L)可促進H2O2誘導HUVECs的凋亡,其機制有待進一步研究。
　　 4.Res對H2O2誘導的HU