TTF1-NP誘導(dǎo)人肝癌Hepg-2細(xì)胞自噬的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：探討5，2'，4'-三羥基-6，7，5'-三甲氧基黃酮(TTF1-NP)對人肝癌HepG-2自噬的影響及其相關(guān)的作用機(jī)制
　　方法：通過MTT法檢測不同濃度(15-240μM)的TTF1-NP作用不同時(shí)間(12h，24 h，48 h)后對HepG-2細(xì)胞存活率的影響;利用透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM）觀察細(xì)胞中自噬體的形成;Western Blot檢測TTF1-NP

2、在不同濃度和不同時(shí)間下作用HepG-2細(xì)胞后自噬標(biāo)志蛋白LC3-Ⅱ、Beclin-1的表達(dá)，及PI3K/Akt/mTOR通路中Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR和MAPK/JNK通路中p-JNK的蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：1.MTT法細(xì)胞活力檢測:TTF1-NP能夠降低HepG-2細(xì)胞的存活率，并且隨著藥物濃度和作用時(shí)間的增加，抑制增殖作用越明顯，且呈現(xiàn)一定的濃度-時(shí)間依賴性，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.透射電子顯

3、微鏡檢測:TTF1-NP作用后，HepG-2細(xì)胞中有典型雙層膜結(jié)構(gòu)的自噬體及單層膜的自噬溶酶體出現(xiàn)，提示TTF1-NP誘導(dǎo)HepG-2細(xì)胞自噬的產(chǎn)生。
　　3.自噬標(biāo)志蛋白檢測:利用Westem Blot對LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白檢測得出，對照組中，兩種蛋白表達(dá)水平較低，隨著藥物濃度及作用時(shí)間的增加，LC3-Ⅱ、Beclin-1蛋白表達(dá)水平逐漸增加，自噬水平升高。
　　4.PI3K/Akt/mTOR通路蛋白檢測:We

4、stern Blot檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞p-Akt，p-mTOR表達(dá)水平較高，隨著TTF1-NP藥物濃度和作用時(shí)間增加，二者的表達(dá)逐漸降低;加入PI3K/Akt/mTOR通路激動(dòng)劑insulin后，與對照組相比，insulin+對照組中的p-Akt，p-mTOR表達(dá)升高（P＜0.05）; TTF1-NP+insulin組中p-Akt，p-mTOR較TTF1-NP組表達(dá)升高(P＜0.01)，LC3-Ⅱ表達(dá)降低(P＜0.01)，差異具有

5、統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5.MAPK/JNK通路蛋白檢測:Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)，p-JNK隨著TTF1-NP藥物濃度和作用時(shí)間的增加表達(dá)逐漸升高。加入JNK抑制劑SP600125后，TTF1-NP+SP600125組中的p-JNK、LC3-Ⅱ的蛋白水平較TTF1-NP組降低，差異顯著，而與對照組相比，二組中的兩蛋白顯著升高(P＜0.01)。
　　結(jié)論：TTF1-NP可以誘導(dǎo)人肝癌HepG-2自噬。TTF1-NP誘導(dǎo)人肝