普羅布考對乙醛刺激的大鼠肝星狀細胞的作用及其分子機制研究.pdf

1、肝纖維化(liver fibrosis)是對包括病毒、自身免疫、藥物、酒精、膽汁淤積以及代謝性疾病在內(nèi)的各種病因所致的慢性肝損傷的修復反應，是一種以細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度沉積為特征的病理生理過程，它是多種慢性肝病發(fā)展演變?yōu)楦斡不谋亟?jīng)階段。目前認為肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生的關鍵環(huán)節(jié)，活化的HSC是細胞外基質(zhì)的主要來源，并能產(chǎn)生

2、大量致纖維化細胞因子，在肝纖維化發(fā)展過程中起重要作用。而乙醇的代謝產(chǎn)物—乙醛作為有效刺激信號可以活化HSC內(nèi)多條與HSC生物學行為有關的信號傳導通路，在調(diào)控HSC活化、增殖、細胞外基質(zhì)分泌等方面起重要作用，是導致酒精性肝纖維化發(fā)生的關鍵因素。
　　近年來有不少的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與肝星狀細胞的活化及肝纖維化的發(fā)生密切相關，而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinas

3、e，MAPK)包括ERK、JNK、P38信號通路也是調(diào)控HSC活化與增殖導致肝纖維化發(fā)生的主要信號傳導通路之一。Wnt/β-catenin和MAPK/ERK信號通路對HSC的DNA合成、細胞生存和ECM合成發(fā)揮關鍵作用，阻斷任一途徑皆可抑制HSC增殖和ECM分泌，進而阻止肝纖維化的進展。
　　普羅布考(Probucol)，又名丙丁酚，最初以降脂藥應用于臨床，主要降低血清膽固醇，隨著對其藥理作用的認識不斷深入，發(fā)現(xiàn)其有抗氧化及抗動脈

4、粥樣硬化作用，最近的研究還發(fā)現(xiàn)它在內(nèi)膜細胞和系膜細胞具有抗增殖作用。已有研究證實，普羅布考對增殖信號通路Raf/MEK/ERK有明顯抑制作用且能夠顯著下調(diào)p-ERK1/2的水平，從而抑制阿霉素導致的心肌纖維化。另一項研究表明，普羅布考能夠通過抑制JAK2/STAT途徑的活化，減低TGF-β1和CTGF等細胞因子的表達，從而減少高糖誘導的人腎小球系膜細胞ECM積聚。晚近一項研究提示普羅布考通過降低肝臟氧化應激水平而減輕四氯化碳誘導的大鼠肝

5、纖維化，但有關普羅布考對wnt/β-catenin信號通路的影響及其對酒精性肝纖維化保護作用的機制國內(nèi)外尚未見報道。
　　目的：
　　基于這些發(fā)現(xiàn)，我們假設普羅布考可以抑制HSC的增殖和細胞外基質(zhì)的分泌，是一種潛在的治療肝纖維化的新選擇。為了證明這一假設，我們建立酒精性肝纖維化的細胞模型進行以下實驗:觀察普羅布考是否能夠抑制乙醛誘導的HSC-T6細胞的增殖;明確普羅布考對乙醛刺激后細胞周期各時相及其相關的蛋白和激酶抑制劑的影

6、響;同時觀察普羅布考是否能夠抑制乙醛誘導的HSC-T6細胞的活化及分泌細胞因子的影響并探討其作用的分子機制。
　　方法：
　　1、體外培養(yǎng)大鼠HSC-T6細胞株，cck8法檢測普羅布考(終濃度20，40，80，160μmol/L)對乙醛(終濃度200μmol/L)刺激的HSC增殖的影響。
　　2、免疫細胞化學法檢測普羅布考(終濃度40，80μmol/L)對乙醛刺激的HSC-T6細胞cyclinD1、 p27kip1、α

7、-SMA和FN蛋白表達的影響。
　　3、流式細胞術檢測普羅布考(終濃度40，80μmol/L)對乙醛刺激的HSC-T6細胞周期分布的影響。
　　4、實時熒光定量PCR法檢測普羅布考對HSC-T6細胞α-SMA、FN、CTGF和PAI-1等細胞因子表達。
　　5、Western blot法檢測普羅布考對HSC-T6細胞因子CTGF，PAI-1和信號轉(zhuǎn)導通路相關蛋白β-catenin，磷酸化GSK-3β和ERKI/2等蛋白

8、表達的影響;檢測乙醛作用不同時點對HSC-T6細胞核β-catenin蛋白表達的影響;檢測100ng/ml Dkk1和50μmol/L PD98059對乙醛刺激的HSC-T6細胞α-SMA和cyclinD1蛋白表達的影響。
　　結果：
　　1、200μmol/L的乙醛可以促進HSC-T6細胞的增殖，12h、24h和48h細胞相對增殖率分別為117.91％，124.44％、135.01％，在48h促細胞增殖作用最為明顯。不同濃

9、度的普羅布考在各時點對HSC-T6細胞的增殖具有不同程度的抑制作用，隨著藥物濃度和作用時間的增加，抑制率增高，具有一定的時間和濃度依賴性。在48h時20、40、80和160μmol/L普羅布考對乙醛刺激的HSC-T6的抑制率分別為16.45％、31.44％、75.12％和83.55％。
　　2、流式細胞學檢測結果顯示200μmol/L的乙醛促使HSC-T6細胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，S期細胞與正常對照組比較有顯著性差異(46.0

10、2±3.04 vs22.18±3.21P＜0.01)。普羅布考作用HSC-T6細胞24小時后，使G0/G1期細胞比例上升，而S期細胞比例下降，且呈劑量依賴性。普羅布考阻斷HSC細胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制細胞DNA合成，抑制細胞分裂，使細胞周期進程減緩，阻止其發(fā)生增殖。
　　3、細胞免疫化學結果顯示，與乙醛刺激組比較，普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，cyclinD1蛋白表達強度呈逐漸減弱趨勢，而p27kip1蛋白

11、表達強度呈逐漸增強趨勢，有顯著性差異;RT-PCR結果顯示，與對照組比較，乙醛組cyclinD1 mRNA的表達明顯增強;經(jīng)普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，cyclinD1表達呈逐漸減弱趨勢，與對照組比較，乙醛組p27kip1mRNA的表達明顯減弱;經(jīng)普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，p27kip1表達呈逐漸增強趨勢，有顯著性差異。
　　4、免疫細胞化學結果顯示，與乙醛刺激組比較，普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增

12、加，α-SMA和FN蛋白表達強度呈逐漸減弱趨勢。RT-PCR結果顯示，與對照組比較，乙醛組α-SMA和FN mRNA的表達明顯增強;經(jīng)普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，α-SMA和FN mRNA表達呈逐漸減弱趨勢。
　　5、Westem blot及RT-PCR結果顯示，與對照組比較，乙醛組CTGF和PAI-1蛋白及mRNA的表達明顯增強;經(jīng)普羅布考干預后，隨著普羅布考濃度的增加，CTGF和PAI-1蛋白及mRNA的表達呈逐漸

13、減弱趨勢，各組間有顯著差異。
　　6、乙醛呈時間依賴促進β-catenin蛋白的表達。Wnt抑制劑Dkk1(100ng/ml)和ERK阻滯劑PD98059(50μmol/L)均可以抑制乙醛刺激的HSC-T6細胞的增殖和活化。
　　7、普羅布考干預24 h后明顯抑制了乙醛誘導的HSC-T6細胞核β-catenin的表達，同時抑制了GSK-3β和ERK1/2的磷酸化。
　　結論：
　　1、普羅布考呈濃度與時間依賴性抑

14、制乙醛刺激的HSC-T6細胞的增殖，且它抑制因乙醛活化而升高的細胞周期相關蛋白cyclinD1的表達，同時上調(diào)周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑P27kip-1的表達，調(diào)控細胞周期停滯于G0/G1期，從而發(fā)揮抑制大鼠肝星狀細胞增殖的作用。
　　2、普羅布考呈劑量依賴方式抑制乙醛誘導的肝星狀細胞α-SMA和FN mRNA及蛋白的表達。同時普羅布考還可以抑制乙醛誘導的HSC-T6細胞因子CTGF和PAI-1mRNA及蛋白的表達。
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