普羅布考對乙醛刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞的作用及其分子機(jī)制研究.pdf

1、肝纖維化(liver fibrosis)是對包括病毒、自身免疫、藥物、酒精、膽汁淤積以及代謝性疾病在內(nèi)的各種病因所致的慢性肝損傷的修復(fù)反應(yīng)，是一種以細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度沉積為特征的病理生理過程，它是多種慢性肝病發(fā)展演變?yōu)楦斡不谋亟?jīng)階段。目前認(rèn)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化與增殖是肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，活化的HSC是細(xì)胞外基質(zhì)的主要來源，并能產(chǎn)生

2、大量致纖維化細(xì)胞因子，在肝纖維化發(fā)展過程中起重要作用。而乙醇的代謝產(chǎn)物—乙醛作為有效刺激信號可以活化HSC內(nèi)多條與HSC生物學(xué)行為有關(guān)的信號傳導(dǎo)通路，在調(diào)控HSC活化、增殖、細(xì)胞外基質(zhì)分泌等方面起重要作用，是導(dǎo)致酒精性肝纖維化發(fā)生的關(guān)鍵因素。
　　近年來有不少的研究表明，Wnt/β-catenin信號通路與肝星狀細(xì)胞的活化及肝纖維化的發(fā)生密切相關(guān)，而絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinas

3、e，MAPK)包括ERK、JNK、P38信號通路也是調(diào)控HSC活化與增殖導(dǎo)致肝纖維化發(fā)生的主要信號傳導(dǎo)通路之一。Wnt/β-catenin和MAPK/ERK信號通路對HSC的DNA合成、細(xì)胞生存和ECM合成發(fā)揮關(guān)鍵作用，阻斷任一途徑皆可抑制HSC增殖和ECM分泌，進(jìn)而阻止肝纖維化的進(jìn)展。
　　普羅布考(Probucol)，又名丙丁酚，最初以降脂藥應(yīng)用于臨床，主要降低血清膽固醇，隨著對其藥理作用的認(rèn)識不斷深入，發(fā)現(xiàn)其有抗氧化及抗動脈

4、粥樣硬化作用，最近的研究還發(fā)現(xiàn)它在內(nèi)膜細(xì)胞和系膜細(xì)胞具有抗增殖作用。已有研究證實，普羅布考對增殖信號通路Raf/MEK/ERK有明顯抑制作用且能夠顯著下調(diào)p-ERK1/2的水平，從而抑制阿霉素導(dǎo)致的心肌纖維化。另一項研究表明，普羅布考能夠通過抑制JAK2/STAT途徑的活化，減低TGF-β1和CTGF等細(xì)胞因子的表達(dá)，從而減少高糖誘導(dǎo)的人腎小球系膜細(xì)胞ECM積聚。晚近一項研究提示普羅布考通過降低肝臟氧化應(yīng)激水平而減輕四氯化碳誘導(dǎo)的大鼠肝

5、纖維化，但有關(guān)普羅布考對wnt/β-catenin信號通路的影響及其對酒精性肝纖維化保護(hù)作用的機(jī)制國內(nèi)外尚未見報道。
　　目的：
　　基于這些發(fā)現(xiàn)，我們假設(shè)普羅布考可以抑制HSC的增殖和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌，是一種潛在的治療肝纖維化的新選擇。為了證明這一假設(shè)，我們建立酒精性肝纖維化的細(xì)胞模型進(jìn)行以下實驗:觀察普羅布考是否能夠抑制乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的增殖;明確普羅布考對乙醛刺激后細(xì)胞周期各時相及其相關(guān)的蛋白和激酶抑制劑的影

6、響;同時觀察普羅布考是否能夠抑制乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞的活化及分泌細(xì)胞因子的影響并探討其作用的分子機(jī)制。
　　方法：
　　1、體外培養(yǎng)大鼠HSC-T6細(xì)胞株，cck8法檢測普羅布考(終濃度20，40，80，160μmol/L)對乙醛(終濃度200μmol/L)刺激的HSC增殖的影響。
　　2、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測普羅布考(終濃度40，80μmol/L)對乙醛刺激的HSC-T6細(xì)胞cyclinD1、 p27kip1、α

7、-SMA和FN蛋白表達(dá)的影響。
　　3、流式細(xì)胞術(shù)檢測普羅布考(終濃度40，80μmol/L)對乙醛刺激的HSC-T6細(xì)胞周期分布的影響。
　　4、實時熒光定量PCR法檢測普羅布考對HSC-T6細(xì)胞α-SMA、FN、CTGF和PAI-1等細(xì)胞因子表達(dá)。
　　5、Western blot法檢測普羅布考對HSC-T6細(xì)胞因子CTGF，PAI-1和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白β-catenin，磷酸化GSK-3β和ERKI/2等蛋白

8、表達(dá)的影響;檢測乙醛作用不同時點對HSC-T6細(xì)胞核β-catenin蛋白表達(dá)的影響;檢測100ng/ml Dkk1和50μmol/L PD98059對乙醛刺激的HSC-T6細(xì)胞α-SMA和cyclinD1蛋白表達(dá)的影響。
　　結(jié)果：
　　1、200μmol/L的乙醛可以促進(jìn)HSC-T6細(xì)胞的增殖，12h、24h和48h細(xì)胞相對增殖率分別為117.91％，124.44％、135.01％，在48h促細(xì)胞增殖作用最為明顯。不同濃

9、度的普羅布考在各時點對HSC-T6細(xì)胞的增殖具有不同程度的抑制作用，隨著藥物濃度和作用時間的增加，抑制率增高，具有一定的時間和濃度依賴性。在48h時20、40、80和160μmol/L普羅布考對乙醛刺激的HSC-T6的抑制率分別為16.45％、31.44％、75.12％和83.55％。
　　2、流式細(xì)胞學(xué)檢測結(jié)果顯示200μmol/L的乙醛促使HSC-T6細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)換，S期細(xì)胞與正常對照組比較有顯著性差異(46.0

10、2±3.04 vs22.18±3.21P＜0.01)。普羅布考作用HSC-T6細(xì)胞24小時后，使G0/G1期細(xì)胞比例上升，而S期細(xì)胞比例下降，且呈劑量依賴性。普羅布考阻斷HSC細(xì)胞由G0/G1期向S期轉(zhuǎn)變，從而抑制細(xì)胞DNA合成，抑制細(xì)胞分裂，使細(xì)胞周期進(jìn)程減緩，阻止其發(fā)生增殖。
　　3、細(xì)胞免疫化學(xué)結(jié)果顯示，與乙醛刺激組比較，普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，cyclinD1蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈逐漸減弱趨勢，而p27kip1蛋白

11、表達(dá)強(qiáng)度呈逐漸增強(qiáng)趨勢，有顯著性差異;RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，乙醛組cyclinD1 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng);經(jīng)普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，cyclinD1表達(dá)呈逐漸減弱趨勢，與對照組比較，乙醛組p27kip1mRNA的表達(dá)明顯減弱;經(jīng)普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，p27kip1表達(dá)呈逐漸增強(qiáng)趨勢，有顯著性差異。
　　4、免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示，與乙醛刺激組比較，普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增

12、加，α-SMA和FN蛋白表達(dá)強(qiáng)度呈逐漸減弱趨勢。RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，乙醛組α-SMA和FN mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng);經(jīng)普羅布考處理后，隨著普羅布考濃度的增加，α-SMA和FN mRNA表達(dá)呈逐漸減弱趨勢。
　　5、Westem blot及RT-PCR結(jié)果顯示，與對照組比較，乙醛組CTGF和PAI-1蛋白及mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng);經(jīng)普羅布考干預(yù)后，隨著普羅布考濃度的增加，CTGF和PAI-1蛋白及mRNA的表達(dá)呈逐漸

13、減弱趨勢，各組間有顯著差異。
　　6、乙醛呈時間依賴促進(jìn)β-catenin蛋白的表達(dá)。Wnt抑制劑Dkk1(100ng/ml)和ERK阻滯劑PD98059(50μmol/L)均可以抑制乙醛刺激的HSC-T6細(xì)胞的增殖和活化。
　　7、普羅布考干預(yù)24 h后明顯抑制了乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞核β-catenin的表達(dá)，同時抑制了GSK-3β和ERK1/2的磷酸化。
　　結(jié)論：
　　1、普羅布考呈濃度與時間依賴性抑

14、制乙醛刺激的HSC-T6細(xì)胞的增殖，且它抑制因乙醛活化而升高的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白cyclinD1的表達(dá)，同時上調(diào)周期蛋白依賴蛋白激酶抑制劑P27kip-1的表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期停滯于G0/G1期，從而發(fā)揮抑制大鼠肝星狀細(xì)胞增殖的作用。
　　2、普羅布考呈劑量依賴方式抑制乙醛誘導(dǎo)的肝星狀細(xì)胞α-SMA和FN mRNA及蛋白的表達(dá)。同時普羅布考還可以抑制乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞因子CTGF和PAI-1mRNA及蛋白的表達(dá)。
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