穩(wěn)定表達(dá)HCV C蛋白的HepG2細(xì)胞株體外活化肝星狀細(xì)胞的實驗研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)是慢性肝炎的主要致病因子之一，目前全世界約有一億七千萬人受到感染，約占全球人口的3％。HCV的感染很容易持續(xù)存在，引起肝臟慢性炎癥，進(jìn)而導(dǎo)致肝臟纖維化、肝硬化及肝癌等嚴(yán)重后果。肝纖維化是各種慢性肝病向肝硬化發(fā)展的共同病理過程，是影響慢性肝病預(yù)后的重要環(huán)節(jié)。肝纖維化是纖維增生和纖維分解失衡的結(jié)果，其做為一動態(tài)過程，屬可逆性病變。肝纖維化的特征是以膠原

2、為主的細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)各成份因合成增多、降解相對不足而在肝內(nèi)過量沉積。
　　 目前共識，肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)的激活是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。在各種致病因素作用下，靜止期HSC被激活并增殖、轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞(myofibroblasts，MFB)，它可產(chǎn)生大量的ECM，包括：Ⅰ～Ⅳ型膠原、透明質(zhì)酸、結(jié)締組織生長因子、纖維連接蛋白等。目前認(rèn)為Ⅳ型膠原、Ⅲ型前膠原肽、層粘連蛋白及

3、透明質(zhì)酸是最具代表性的肝纖維化血清學(xué)指標(biāo)。而轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)是迄今所知道的最強(qiáng)的促HSC活化的細(xì)胞因子，在肝纖維化中起著核心作用。
　　 核心區(qū)基因是HCV基因組中最為保守的結(jié)構(gòu)區(qū)域，有證據(jù)表明它編碼的C蛋白是一種多功能蛋白質(zhì)，能參與病毒復(fù)制、脂質(zhì)代謝紊亂、丙型肝炎的慢性化、肝纖維化和肝癌的發(fā)生發(fā)展以及抑制免疫反應(yīng)、影響干擾素的治療效果。我們推測HCV核心蛋白可能參與了ECM的合成與降解的調(diào)控，從而影響著肝纖維

4、化的發(fā)生、發(fā)展。
　　 本實驗的目的是擴(kuò)增HCV C基因的全序列，構(gòu)建能夠穩(wěn)定表達(dá)核心蛋白的細(xì)胞株，采用體外培養(yǎng)的肝星狀細(xì)胞作為研究的靶細(xì)胞，來研究核心蛋白對HSC活化及合成ECM的影響，以期了解HCV核心蛋白的致肝纖維化機(jī)制，為研究HCV的致病作用奠定基礎(chǔ)。
　　 研究內(nèi)容和方法：
　　 提取HCV陽性病人血清中的病毒總RNA，用AMV RTase XL逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中HCV1b和

5、2a型全序列，設(shè)計一對能擴(kuò)增5'末端約1100bp片段的引物，PCR產(chǎn)物連接入pGEM-T Easy載體，藍(lán)白篩選得到陽性克隆，委托公司測序。測序結(jié)果利用DNAstar軟件及GenBank資源進(jìn)行序列分析、比對。進(jìn)而以質(zhì)粒pGEM-T Easy-HCV1100為模板特異性擴(kuò)增HCV C基因全序列，構(gòu)建真核表達(dá)載體pEGFP-C3-HCV-C轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)核心蛋白的HepG2-HCV-C細(xì)胞株。并用SDS

6、-PAGE和WesternBlot鑒定C蛋白的表達(dá)和抗原特異性。用1640培養(yǎng)基作陰性對照，ELISA法檢測HepG2-HCV-C和HepG2細(xì)胞株培養(yǎng)液中TGF-β1的表達(dá)。另外用這兩株細(xì)胞的上清液來培養(yǎng)人肝星狀細(xì)胞系LX-2細(xì)胞，同時用DMEM培養(yǎng)LX-2細(xì)胞作對照，分別制備細(xì)胞爬片，用免疫細(xì)胞化學(xué)染色法分別檢測LX-2細(xì)胞中人α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)和纖維連接蛋白(FN)

7、的表達(dá)情況。同時ELISA法分析上述三種方式培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞其上清液中人Ⅳ型膠原(ColⅣ)、Ⅲ型前膠原肽(PⅢ NP)、透明質(zhì)酸(HA)和人層粘連蛋白(LN)分泌表達(dá)的情況。所有數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。
　　 結(jié)果：
　　 本實驗從HCV陽性病人的血清標(biāo)本中擴(kuò)增出了完整的HCV C基因的編碼序列，經(jīng)同源性分析，與國內(nèi)HCV1b型分離株的核苷酸及氨基酸的同源性均為95％以上。成功構(gòu)建HCV C基因

8、全序列的真核表達(dá)載體pEGFP-C3-HCV-C，轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞系HepG2細(xì)胞，經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot鑒定獲得穩(wěn)定表達(dá)核心蛋白的HepG2-HCV-C細(xì)胞株。
　　 ELISA檢測結(jié)果顯示，HepG2-HCV-C細(xì)胞1～6天培養(yǎng)液中TGF-β1的量(pg/ml)(110.00±28.45，290.00±61.16，455.00±28.46，871.67±41.35，939.16±49.85，935.00±

9、53.06)顯著高于HepG2細(xì)胞(0，12.50±38.78，35.83±29.35，76.67±15.63，122.5±32.89，124.16±29.35)，F(xiàn)=21984.81，p＜0.001。兩株細(xì)胞間同一時間點的兩兩比較均顯示P＜0.01，提示HCV C蛋白表達(dá)的肝癌細(xì)胞系分泌TGF-β1的量明顯增加。
　　 免疫細(xì)胞化學(xué)染色結(jié)果顯示用HepG2-HCV-C細(xì)胞株上清液培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞人α-平滑肌肌動蛋白(α-SM

10、A)、Ⅳ型膠原(ColⅣ)、結(jié)締組織生長因子(CTGF)、纖維連接蛋白(FN)四種因子均為彌漫陽性，細(xì)胞染成深褐色；用HepG2培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞呈局灶性棕黃色，DMEM培養(yǎng)的LX-2細(xì)胞染色陰性。
　　 另外經(jīng)分析，LX-2(HepG2-HCV-C)組ColⅣ的值明顯高于LX-2(HepG2)組(F=3977.80，p＜0.001)和LX-2(DMEM)組(F=1305.29，p＜0.01)；HA的值明顯高于LX-2(HepG

11、2)組(F=13365.12，p＜0.001)和LX-2(DMEM)組(F=2604.61，p＜0.001)；LN的值明顯高于LX-2(HepG2)組(F=880.92，p=0.001)和LX-2(DMEM)組(F=8573.96，p＜0.001)。同樣，LX-2(HepG2-HCV-C)組PⅢ NP的值與LX-2(HepG2)組比較有差異(F=23.67，p=0.04)，與LX-2(DMEM)組相比也有顯著增高(F=88.63，p=0

12、.011)。提示核心蛋白對HSC活化及ECM合成存在一定影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.利用PCR技術(shù)擴(kuò)增了HCVC基因的全序列，經(jīng)同源性分析，與1b型分離株的核苷酸及氨基酸的同源性均為95％以上。
　　 2.利用基因工程技術(shù)成功構(gòu)建了HCV C基因全序列的真核表達(dá)載體，體外轉(zhuǎn)染獲得穩(wěn)定表達(dá)核心蛋白的HepG2-HCV-C細(xì)胞株。為進(jìn)一步研究HCV核心蛋白的功能奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 3.ELISA分析顯