Let-7a內(nèi)源性小分子RNA對人乳腺癌MCF-7細胞株的生長抑制作用.pdf

1、掘資料統(tǒng)計,我國乳腺癌發(fā)病率占全身各種惡性腫瘤的7-10％,隨著人口城市化的加速,乳腺癌發(fā)生率及病死率有逐年上升的趨勢,特別在沿海城市,發(fā)病率較以前有明顯的增長。乳腺癌的發(fā)病多與遺傳有關(guān),發(fā)病年齡通常在40-60歲之間,絕經(jīng)期前后的婦女發(fā)病率較高,是嚴重影響婦女身心健康甚至危及生命的最常見的惡性腫瘤之一。目前手術(shù)治療仍然是乳腺癌治療的主要手段,手術(shù)治療經(jīng)歷了由不做手術(shù)、擴大范圍的根治術(shù)、改良根治術(shù),以及目前主張的保乳手術(shù)的演變過程,隨著

2、化療、放療及內(nèi)分泌等綜合治療的應(yīng)用,乳腺癌患者的生存率已經(jīng)有了明顯的提高,但仍有相當一部分患者存在復(fù)發(fā)或?qū)ΤＲ?guī)治療耐藥問題。因此,找到一種新型的抗癌藥物與治療手段顯得尤為必要。
　　 隨著對惡性腫瘤發(fā)病的基因和分子機制研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤從遺傳學(xué)和分子生物學(xué)角度來看,是一種基因病,即癌基因的激活和抑癌基因的失活以及基因表達調(diào)控失常所致。腫瘤的發(fā)生分子基礎(chǔ)是多種基因突變長期、多階段、多步驟的積累過程。以腫瘤細胞中特有的

3、結(jié)構(gòu)、功能區(qū)域、分子基團、生物酶以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路為治療位點,通過調(diào)節(jié)或阻斷這些分子功能達到治療疾病目的的靶向治療藥物已經(jīng)問世,并在臨床得到應(yīng)用。由于這類藥物對腫瘤細胞起調(diào)節(jié)作用和穩(wěn)定性作用,且具有非細胞毒性和靶向性的特點,必將成為一種新的腫瘤治療手段。
　　 RNA干擾(RNA interference,RNAi)現(xiàn)象是由與靶基因序列同源的雙鏈RNA(double-strand RNA,dsRNA)引發(fā)的廣泛存在于生物體中的序列

4、特異性基因轉(zhuǎn)錄后的沉默過程。利用RNAi技術(shù)可以使mRNA發(fā)生特異性的降解,導(dǎo)致其相應(yīng)的基因沉默,這種轉(zhuǎn)錄后基因沉默機制(post-transcriptional geneSilencing,PTGS)最終抑制蛋白表達。dsRNA在細胞內(nèi)發(fā)揮作用的是21-23核昔酸長的小分子干擾RNA片段(small interfering RNAs,SiRNAs)。由于RNAi對染色體DNA序列的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程不產(chǎn)生任何影響,具有高度的序列特異性和抑

5、制基因表達的高效性,而且RNAi的效應(yīng)可以在不同細胞間長距離傳遞和維持,或在某些生物中具有遺傳性,所以迅速成為一種功能強大的研究哺乳動物中選擇性抑制特異性基因表達和研究基因功能的工具。
　　 微小RNA(micro-RNA,miRNA)是真核生物中一類長度在18-25個核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA,也是dsRNA的一種。miRNA通過識別其相應(yīng)的靶mRNA,可以降解mRNA或抑制mRNA轉(zhuǎn)錄后的翻譯,從而抑制蛋白的合成。miR

6、NA基因表達在多種惡性腫瘤中均有明顯的改變,包括慢性淋巴細胞白血病,小兒伯基特淋巴瘤,胃癌,肺癌,大細胞淋巴瘤等。在腫瘤的形成過程中,miRNA的生物合成的異常使得腫瘤細胞基因表達發(fā)生異常,發(fā)揮著類似癌基因和抑癌基因作用,最終導(dǎo)致發(fā)育缺陷和癌癥形成。
　　 Let-7是目前研究較多的一種miRNA,在研究線蟲過程中首次發(fā)現(xiàn),其在細胞生長分化、細胞凋亡、組織發(fā)育、脂肪代謝及胚胎干細胞的形成過程中發(fā)揮著重要作用。腫瘤細胞中l(wèi)et-7

7、家族通常是下調(diào)的,過去的大量研究表明,let-7被認為是腫瘤的抑制者及細胞終分化和增殖的調(diào)控器,其在腫瘤細胞形成、增殖及凋亡中均發(fā)揮著重要作用。利用let-7干擾腫瘤細胞的生長可能成為一種新的腫瘤治療手段。
　　 Let-7通過調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子在細胞生長、細胞分化調(diào)控、與細胞凋亡中發(fā)揮著重要作用。c-myc基因?qū)儆趍yc原癌基因家族,定位于染色體8q24,c-myc基因主要通過擴增和染色體易位重排的方式激活,在某些組織腫瘤的發(fā)生、發(fā)

8、展和演變轉(zhuǎn)歸過程中發(fā)揮重要關(guān)系。c-myc癌基因?qū)俸说鞍谆?具有轉(zhuǎn)化細胞的能力,并具有與染色體DNA結(jié)合的特性,在調(diào)節(jié)細胞生長、分化及惡性轉(zhuǎn)化中發(fā)揮作用。c-myc的表達活性與細胞生長、分裂速度密切相關(guān),而且也是細胞凋亡的潛在誘導(dǎo)因子。在不同的人體腫瘤細胞系中,包括粒細胞性白血病細胞系,視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞系,某些神經(jīng)母細胞病細胞系,乳腺癌細胞系及某些肺癌細胞系,已發(fā)現(xiàn)c-myc過度表達。c-myc基因還參與了腫瘤的血管新生,在腫瘤的生

9、成過程中,c-myc基因扮演著控制血管生長作用,其在腫瘤生長增殖及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮的重要作用。IMPI基因是一種與let-7高度互補的癌胚基因,一般只在早期胚胎干細胞和一些癌細胞中表達。Let-7能夠靶向干擾IMP1,使IGF-IR磷酸化,進而激活Ras-MAPK途徑和PI3K-Akt/PKB途徑信號傳導(dǎo)通路,控制相應(yīng)信號傳導(dǎo)通路中關(guān)鍵基因的表達,調(diào)節(jié)腫瘤細胞的生長、分化、增殖、凋亡。C-myc基因是PI3K-Akt/PKB信號傳導(dǎo)通路的關(guān)鍵

10、基因之一,其在乳腺癌細胞增殖、凋亡、分化、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮著重要的作用。以往進行的實驗表明,myc基因可以與let-7的啟動子結(jié)合,間接下調(diào)let-7的轉(zhuǎn)錄。采用計算機進行序列分析發(fā)現(xiàn)let-7與myc存在高度互補,這為探索let-7干擾乳腺癌細胞機制提供了理論依據(jù)。
　　 基于前述國內(nèi)外研究現(xiàn)狀,在小分子RNA干擾技術(shù)日漸成熟的基礎(chǔ)上,本研究擬合成let-7a,利用脂質(zhì)體將其導(dǎo)入乳腺癌MCF-7細胞中,運用CCK-8及流式細胞術(shù)檢測

11、乳腺癌細胞的增殖及凋亡情況,運用反轉(zhuǎn)錄PCR和免疫印跡的方法檢測c-myc基因及蛋白表達情況,探索let-7a對乳腺癌細胞的作用機制。
　　 目的
　　 人工設(shè)計合成經(jīng)HPLC純化let-7a,利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染體外生長的人乳腺癌MCF-7細胞,觀察其對的細胞增殖、凋亡的影響,并利用分子生物學(xué)實驗檢測乳腺癌細胞中c-myc的基因及蛋白表達情況,探索其可能的作用機制。為miRNA應(yīng)用于乳腺癌的基因治療提供理論及實驗依據(jù)。

12、>　　 方法
　　 1.根據(jù)GenBank中報道的let-7a基因核苷酸序列,使用BLAST排除和其他編碼序列/EST同源的序列,人工設(shè)計合成Let-7a及陰性對照siRNA,合成以雙鏈形式保存,末端以綠色熒光蛋白標記,利用脂質(zhì)體LipofectamineTM2000,將let-7a轉(zhuǎn)染至乳腺癌MCF-7細胞中,分別轉(zhuǎn)染6h、12h、24h后,利用光學(xué)顯微鏡觀察細胞膜及細胞核的變化,利用熒光顯微鏡觀察細胞轉(zhuǎn)染情況；
　　

13、 2.Let-7a組設(shè)200nmol/L、100 nmol/L、50 nmol/L、20 nmol/L四個組,陰性對照siRNA濃度為100 nmol/L,另設(shè)空白對照組,共六個組。使用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染MCF-7細胞,分別設(shè)24h、48h、72h三個時間點,加入CCK-81h后分光光度計檢測OD值,計算細胞生長抑制率,檢測人乳腺癌MCF-7細胞增殖及凋亡情況。
　　 3.設(shè)let-7a組(濃度為100nmol/L)及脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染組,轉(zhuǎn)

14、染72h后加入AnnexinV-FITC及PI試劑,流式細胞儀(FCM)檢測let-7a對人乳腺痛MCF-7細胞凋亡的影響；
　　 4.分為let-7a組、陰性對照siRNA組(濃度為100nmol/L)及脂質(zhì)體對照組,逆轉(zhuǎn)錄多聚酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)方法檢測脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48h后MCF-7細胞中c-myc基因mRNA的表達,以內(nèi)參校正灰度值,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析后比較各處理組的差別；
　　 5.實驗分let-7a組、陰性對照si

15、RNA組(濃度為100nmol/L)及脂質(zhì)體對照組三個組,Western blot方法檢測轉(zhuǎn)染48h后MCF-7細胞中c-myc蛋白的表達,比較各處理組校征灰度值的差異；
　　 結(jié)論
　　 1.let-7a可以抑制人乳腺癌MCF-7細胞的增殖,并促進MCF-7細胞凋亡；
　　 2.let-7a可以干擾乳腺癌MCF-7細胞中的c-myc基因及蛋白的表達,這可能是let-7a干擾乳腺癌細胞生長及促進細胞凋亡的機制；<