miR-34b對(duì)人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞輻射敏感性影響的研究.pdf

1、目的:Ly-GDI,又稱(chēng)D4-GDI、RhoGDI2或RhoGDIβ,是RhoGDP解離抑制因子家族的成員之一,其對(duì)細(xì)胞凋亡及侵襲等很多方面都起到調(diào)節(jié)作用。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建miR-34b慢病毒載體,外源性恢復(fù)miR-34b在人乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞中的表達(dá),研究其聯(lián)合射線(xiàn)對(duì)細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響,并進(jìn)一步探討miR-34b對(duì)Ly-GDI及其相關(guān)信號(hào)通路分子的調(diào)控作用機(jī)制。
　　方法:
　　1.設(shè)計(jì)合成

2、miR-34b前體序列,經(jīng)退火及磷酸化后形成二聚體。pLentiLox3.7(pLL3.7)質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后與miR-34b連接,菌體PCR以及質(zhì)粒PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,同時(shí)測(cè)序驗(yàn)證其正確性;脂質(zhì)體法將構(gòu)建的質(zhì)粒載體與包裝質(zhì)粒pVSVG、△8.9共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,收集病毒液并用梯度稀釋法檢測(cè)重組慢病毒的滴度;用構(gòu)建好的慢病毒載體感染人乳腺癌 MDA-MB-231和 MCF-7細(xì)胞并觀(guān)察感染效率。
　　2.繪制miR-34

3、b慢病毒感染或不同劑量 X線(xiàn)照射后的細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn);MTT比色法和克隆形成法分析細(xì)胞增殖情況;Annexin V-FITC凋亡檢測(cè)試劑盒染色,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)信號(hào)通路蛋白如Ly-GDI和Bcl-2的表達(dá)情況。
　　3.體外劃痕實(shí)驗(yàn)觀(guān)察miR-34b聯(lián)合電離輻射對(duì)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的影響;Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-34b聯(lián)合電離輻射對(duì)細(xì)胞侵襲以及遷移能力

4、的影響;western blot檢測(cè)Ly-GDI以及相關(guān)信號(hào)通路蛋白如MMP-2、integrin-β1、RhoA的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.測(cè)序結(jié)果證實(shí)本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的慢病毒質(zhì)粒載體序列完全正確(100％匹配),梯度稀釋法測(cè)得pLL3.7-miR-34b的滴度為7.81×107TU/mL,pLL3.7-miR-NC的滴度為2.38×108TU/mL;熒光顯微鏡觀(guān)察到pLL3.7-miR-34b及pLL3.7-miR-NC

5、對(duì)MDA-MB-231和MCF-7兩種細(xì)胞的感染效率均達(dá)到了95％以上。
　　2.miR-34b慢病毒感染3d后對(duì)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的生長(zhǎng)有抑制作用,并且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化;MDA-MB-231和MCF-7兩種細(xì)胞的生長(zhǎng)速度分別在受到2、4、6GyX線(xiàn)照射后5、3、2d變慢,而且前者受到的抑制作用大于后者;MTT和克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)miR-34b聯(lián)合射線(xiàn)抑制MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的增殖;流式細(xì)胞儀檢測(cè)

6、到miR-34b聯(lián)合射線(xiàn)促進(jìn)MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞的凋亡能力;western blot檢測(cè)到miR-34b聯(lián)合電離輻射后MDA-MB-231細(xì)胞中Ly-GDI和Bcl-2蛋白表達(dá)下調(diào),而MCF-7細(xì)胞中未檢測(cè)到Ly-GDI的表達(dá),但Bcl-2的表達(dá)下調(diào)。
　　3.體外劃痕實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-34b聯(lián)合射線(xiàn)降低MDA-MB-231細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力,而對(duì)MCF-7細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力無(wú)影響;Transwell侵襲以及遷移實(shí)驗(yàn)證實(shí)mi

7、R-34b聯(lián)合射線(xiàn)可以抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲及遷移能力,而對(duì)MCF-7細(xì)胞無(wú)影響;western blot檢測(cè)到miR-34b聯(lián)合電離輻射后MDA-MB-231細(xì)胞中與侵襲遷移相關(guān)蛋白Ly-GDI、MMP-2、integrin-β1、RhoA的表達(dá)下調(diào),而MCF-7細(xì)胞中未檢測(cè)到Ly-GDI的表達(dá),其他蛋白的表達(dá)也無(wú)變化。
　　結(jié)論:
　　1.成功構(gòu)建miR-34b慢病毒載體,并且對(duì)MDA-MB-231和MCF-