2-甲氧基雌二醇通過雌激素受體抑制低氧性肺動脈平滑肌細胞的增殖.pdf

1、目的：肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension,PAH)是以肺動脈壓力升高以及血管中膜增殖重塑、內膜增生為主要特征，從而導致的血管進行性閉塞的一種疾病，其中以早期的肺動脈收縮反應增強及晚期的血管平滑肌細胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖為其主要病理變化，從而導致肺血管結構重建。低氧既可以獨立地促進PAH的發(fā)生，又或者作為協(xié)同危險因素促進PAH的發(fā)生與發(fā)展，低氧

2、性肺動脈高壓(hypoxic pulmonary hypertension,HPH)是 PAH的一個重要類型。2-甲氧基雌二醇(2-methoxyextradiol,2ME)是雌激素在體內的主要代謝產物，具有抑制細胞增殖、調控細胞周期停滯、誘導細胞凋亡等作用，能夠降低血管緊張素II誘導的高血壓，抑制高血壓冠狀動脈血管重塑，抵抗動脈粥樣硬化和血管損傷，抑制內膜增生等。近年來諸多研究表明，2ME在肺動脈高壓中也起到重要保護作用。
　　

3、本實驗旨在從細胞水平研究2-甲氧基雌二醇對低氧造成人肺動脈平滑肌細胞(human pulmonary artery smooth muscle cells,hPASMCs)增殖的影響，并探討雌激素受體(estrogen receptor,ER)在其中的介導作用。
　　方法：
　　1.細胞培養(yǎng)：采用正常hPASMCs進行細胞培養(yǎng)，置于含基礎培養(yǎng)基SMCM、2％胎牛血清、0.5%生長因子和0.5%雙抗的平滑肌細胞培養(yǎng)基中，每2d

4、換液1次，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下，以0.25%胰蛋白酶消化進行傳代培養(yǎng)，實驗所用細胞均處于對數生長期，為第5～8代細胞。在2ME干預之前，實驗細胞被保存在不含FBS的無酚紅DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24h。
　　2.細胞干預：應用第5~8代hPASMCs，首先給予常氧、低氧及不同濃度2ME(0.1、0.5、1、3、5umol/l)干預，細胞分組為常氧組、低氧組、低氧+2ME(0.1umol/l)組、低氧+2ME(0.5umo

5、l/l)組、低氧+2ME(1umol/l)組、低氧+2ME(3umol/l)組、低氧+2ME(5umol/l)組，于倒置顯微鏡下觀察細胞增殖，并行MTT實驗測定不同干預條件下的細胞增殖情況。之后給予ERα抑制劑(MPP)及ERβ抑制劑(PHTPP)分別預處理正常hPASMCs后，給予最適濃度2ME(5umol/l)并置于三氣培養(yǎng)箱內行低氧處理，細胞分組為低氧+2ME(5umol/l)+MPP組、低氧+2ME(5umol/l)+PHTPP

6、組，將細胞再次于倒置顯微鏡下觀察細胞增殖，并行MTT實驗測定細胞增殖情況，并采用RT-PCR法測定不同干預條件下hPASMCs中雌激素受體ERα、ERβ及PCNA的mRNA表達水平，采用Western blot法測定不同干預條件下hPASMCs中雌激素受體ERα、ERβ及PCNA的蛋白表達水平。
　　結果：
　　1. MTT法檢測2ME對hPASMCs增殖的影響與常氧組比較，低氧明顯促進了hPASMCs增殖，而2ME干預后明

7、顯抑制了低氧誘導的hPASMCs增殖且呈濃度依賴性。MPP干預后明顯抑制了2ME對細胞增殖的抑制作用，PHTPP干預后2ME對細胞增殖的抑制作用無明顯改變(見Fig.1、2、3a)；
　　2.hPASMCs中ERα、ERβ、PCNA mRNA表達水平變化常氧組ERαmRNA表達為（3.02±0.07），ERβmRNA為（3.97±0.08），PCNA mRNA為（1.08±0.04），與常氧組相比，低氧組PCNA mRNA（2.5

8、6±0.08）表達水平明顯升高，同時ERα mRNA水平（1.53±0.18）明顯降低，ERβmRNA水平（3.87±0.14）無明顯改變；與低氧組相比，2ME(5umol/L)干預后PCNA mRNA表達水平（1.29±0.02）顯著下降，同時ERαmRNA水平（2.99±0.04）明顯升高，ERβmRNA表達（3.84±0.21）無明顯變化。MPP干預后明顯減弱了2ME對PCNA mRNA水平的抑制及對ERα mRNA水平的促進作用

9、；PHTPP干預后2ME對PCNA mRNA水平抑制作用無明顯改變(見Fig.3b、4a、5a)；
　　3.hPASMCs中ERα、ERβ、PCNA蛋白表達水平變化常氧組ERα蛋白表達為（1.304±0.216），ERβ蛋白為（1.761±0.333），PCNA蛋白為（0.465±0.069），與常氧組相比，低氧組PCNA蛋白表達水平（1.374±0.084）明顯升高，同時ERα蛋白水平（0.646±0.067）明顯降低，ERβ蛋

10、白水平（1.753±0.210）無明顯改變；與低氧組相比，2ME(5umol/L)干預后PCNA蛋白表達水平（0.941±0.053）顯著下降，同時ERα蛋白水平（1.150±0.275）明顯升高，ERβ蛋白表達水平（1.363±0.409）略有下降。MPP干預后明顯減弱了2ME對PCNA蛋白水平的抑制及對ERα蛋白水平的促進作用；PHTPP干預后2ME對PCNA蛋白水平及ERβ蛋白的抑制作用無明顯改變(見Fig.3c、4b、5b)。<