米非司酮對乳腺癌細(xì)胞增殖與凋亡作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的：近年來乳腺癌的發(fā)病率越來越高，每年新發(fā)病例大約130萬，死亡率也呈逐年上升趨勢，乳腺癌已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅婦女生命安全的主要疾病之一。乳腺癌的治療除常規(guī)的手術(shù)、放射治療、化學(xué)治療外，內(nèi)分泌治療也越來越受到重視。在美國內(nèi)分泌治療約占55％，日本約為48％，而我國僅占4％。目前內(nèi)分泌治療藥物如三苯氧胺(TAM)、芳香化酶抑制劑等的療效已得到確認(rèn)，但因其本身的諸多副作用(如TAM可導(dǎo)致子宮內(nèi)膜增厚，甚至子宮內(nèi)膜癌，并可導(dǎo)致血脂升高、血栓形成

2、、脂肪肝等；芳香化酶抑制劑長期服用可導(dǎo)致骨質(zhì)破壞等)，以及激素受體表達(dá)水平的不同，而大大限制了它們的臨床應(yīng)用。能否有一種藥物可以替代上述藥物或與它們協(xié)同發(fā)揮抗腫瘤作用，并減少其副作用，這正是本研究的出發(fā)點(diǎn)。 米非司酮(mifepristone，MIF，RU486)是一種19-去甲睪酮衍生物，對孕激素受體(progesterone receptor,PR)、糖皮質(zhì)激素受體(glucoconicoid receptor，GR)有很

3、強(qiáng)的親和力。有研究發(fā)現(xiàn)，MIF具有抗腫瘤、增強(qiáng)抗癌藥物療效及其它新用途。孕激素在體外實(shí)驗(yàn)中有刺激乳腺癌細(xì)胞增殖的作用，可能與乳腺癌的轉(zhuǎn)移有關(guān)<'[1]>，而MIF為孕激素受體拮抗劑，故可用于乳腺癌治療。體外實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)孕激素拮抗藥或孕激素受體調(diào)節(jié)藥與抗雌激素或芳香化酶抑制藥聯(lián)合作用比單一作用有更強(qiáng)的抗腫瘤作用<'[2]>。已經(jīng)有研究證明米非司酮對PR陽性的乳腺癌細(xì)胞有抑制作用。以往多認(rèn)為MIF的抗腫瘤作用與其抗孕激素作用有關(guān)，但是其在PR

4、陰性腫瘤中表現(xiàn)出的抗腫瘤作用表明MIF的抗腫瘤作用不是抗孕激素單一作用的結(jié)果，其作用機(jī)制遠(yuǎn)比想象的復(fù)雜，即MIF可以在不同條件下通過不同的機(jī)制發(fā)揮作用。本課題設(shè)計(jì)了不同濃度的MIF，觀察其在體外環(huán)境下對ER(++)/PR(++)、ER(-)/PR(-)乳腺癌細(xì)胞系(MCF-7)生長、凋亡及與之相關(guān)的VEGF、bcl-2、Ki67、CerbB-2、P53等因子表達(dá)的影響。探討米非司酮對乳腺癌細(xì)胞生長、調(diào)亡的可能影響機(jī)制，為乳腺癌內(nèi)分泌治

5、療的研究提供新的思路。 方法：ER(++)/PR(++)、ER(-)/PR(-)乳腺癌細(xì)胞系各一株，RPMI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，經(jīng)4～5次傳代使生物學(xué)性狀穩(wěn)定后，對數(shù)生長期細(xì)胞分別接種至培養(yǎng)瓶、24孔板、96孔板。細(xì)胞貼壁后各自隨機(jī)分為空白對照組(加入MIF藥物溶劑，濃度1％)、藥物干預(yù)組(分六組，加入MIF，濃度分別為1.25μg/ml，2.5μg/ml，5.0μg/ml，10.0μg/ml，20.01μg/ml，40.0μg

6、/ml)。最長干預(yù)72小時(shí)。分別于干預(yù)24、48、72小時(shí)后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化；流式細(xì)胞儀測細(xì)胞調(diào)亡率；四唑鹽(MTT)比色法檢測細(xì)胞活力；免疫組織化學(xué)檢測ER、PR、VEGF、bel-2、Ki67、CerbB-2、P53等蛋白的表達(dá)水平；對比上述指標(biāo)在兩組細(xì)胞之間的差異。 結(jié)果：(1)細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果：空白對照組細(xì)胞貼壁均勻的，狀態(tài)良好，各干預(yù)組貼壁細(xì)胞明顯減少，培養(yǎng)液內(nèi)細(xì)胞碎片增多，且隨著藥物劑量的增加和干預(yù)時(shí)

7、間的延長更明顯。(2)四唑鹽(MTT)比色試驗(yàn)結(jié)果：各劑量組OD值較空白對照組顯著降低(p<0.01)，而且與干預(yù)劑量、干預(yù)時(shí)間成反比，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p<0.01)。(3)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果：與空白對照組相比，各干預(yù)組早期調(diào)亡細(xì)胞所占比例顯著增加(p<0.01)，各劑量組間也 顯著差異(p<0.01)。(4)免疫組化結(jié)果：各組ER、PR表達(dá)無明顯差異，而VEGF、bcl-2、Ki67、CerbB-2、P53有顯著差異(p<0.01)

8、。(5)兩株細(xì)胞對比：藥物干預(yù)后，ER(++)/PR(++)組細(xì)胞各項(xiàng)調(diào)亡指標(biāo)均比ER(-)/PR(-)組細(xì)胞有顯著差異(p<0.01)，細(xì)胞活力顯著降低。 結(jié)論：(1)米非司酮對ER(++)/PR(++)和ER(-)/PR(-)％腺癌細(xì)胞株的生長均有抑制作用。(2)米非司酮抑制乳腺癌細(xì)胞株的生長與其促進(jìn)細(xì)胞凋亡有關(guān)，而且呈時(shí)間和劑量依賴性。(3)米非司酮抑制乳腺癌細(xì)胞的生長與其降調(diào)增殖相關(guān)因子水平有關(guān)。(4)米非司酮抑制乳腺癌