AIB1在雌激素受體陽性的乳腺癌中對三苯氧胺耐藥作用的實驗研究.pdf

1、研究背景: 乳腺癌是危及女性的最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在歐美發(fā)達國家多居女性全部腫瘤的首位，國內統(tǒng)計，近年來我國乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)明顯上升，目前已躍居我國女性惡性腫瘤的第二位，且發(fā)病年齡呈年輕化。隨著對乳腺癌生物學特性的深入研究，對乳腺癌的認識也有了全新的概念。目前研究認為乳腺癌自發(fā)病即為全身性疾病，其治療觀念由最初的單純手術治療發(fā)展到以手術為主輔以放療化療內分泌治療，再到目前的綜合治療理論。綜合治療理論中，手術治療的主導

2、地位被動搖，而內分泌治療因治療時間長且效應持久，已超越化療成為乳腺癌最重要的治療手段之一。多項研究證明，內分泌治療的應用大大提高了早期乳腺癌的治療效果，而內分泌治療在晚期乳腺癌的合理應用，也顯著改善了晚期患者的生活質量并延長了患者的生存期。 1896年Beatson首先將卵巢切除術用于治療絕經(jīng)期前婦女的乳腺癌，開創(chuàng)了乳腺癌內分泌治療的先河。上世紀60年代，Toft分離出小鼠雌激素受體（ER）蛋白，70年代ICI46474（Tam

3、oxifen）被發(fā)現(xiàn)對乳腺癌具有治療作用。三苯氧胺于1977年被FDA批準用于進展期乳腺癌，于1986年用于原發(fā)性乳腺癌輔助治療，在1990年用于淋巴結陰性的絕經(jīng)前和絕經(jīng)后乳腺癌的輔助治療。對于ER陽性的乳腺癌患者，三苯氧胺可以使年復發(fā)率下降50％，死亡率下降28％。 以三苯氧胺為代表的選擇性雌激素受體調節(jié)劑應用于乳腺癌已有30余年的歷史，是所有激素受體陽性乳腺癌內分泌治療的首選藥物，并一直作為乳腺癌內分泌治療的金標準。三苯氧胺

4、和雌激素（E）競爭性與ER的激素結合區(qū)結合后，形成激素-受體復合物，引起ER構像改變，使DNA結合區(qū)不能暴露，不能激活基因轉錄，從而拮抗E的許多活性。三苯氧胺可應用于ER（+）、淋巴結陰性和/或陽性的乳腺癌輔助內分泌治療，也可用作高危婦女預防乳腺癌。目前發(fā)現(xiàn)了多種新的內分泌治療藥物，但三苯氧胺的標準治療的地位仍無法被完全取代。三苯氧胺與ER的特性仍是當前研究熱點之一。一項大規(guī)模隨機臨床試驗證實，有數(shù)十萬應用三苯氧胺的乳腺癌患者至今仍保持

5、無病存活。另有研究報道，ER陽性乳腺癌術后輔助內分泌治療效果優(yōu)于或等于化療。然而，三苯氧胺敏感的ER陽性患者仍可能發(fā)生三苯氧胺耐藥。研究發(fā)現(xiàn)ER（+）的乳腺癌患者經(jīng)過5年的三苯氧胺輔助治療，可獲得長期生存率，其效果可以延續(xù)到停藥后5年。但是超過5年的使用將使乳腺癌產(chǎn)生耐藥。臨床上也只有50％的ER（+）的乳腺癌患者起始對抗激素治療有效，之后也會逐漸耐藥，導致腫瘤進展和死亡。因此，研究內分泌治療耐藥的機制、尋找克服耐藥的方法有十分重要的臨

6、床意義。 乳腺癌擴增性抗原1（amplifled in breast cancer1，AIBI）為近年來發(fā)現(xiàn)的細胞核激素受體共激活劑P160 SRC家族成員，是新定義的一個原癌基因。AIBI基因定位于人染色體20q12，因最初發(fā)現(xiàn)于人乳腺癌細胞株擴增的染色體區(qū)，故被命名為乳腺癌擴增性抗原1（AIB1）。體外轉染實驗顯示P160甾體激素受體共激活劑基因家族能增強細胞核受體（nuclear receptor，NR）的活性，通過補充組

7、蛋白乙酰轉移酶和組蛋白甲基轉移酶發(fā)揮重要作用。研究顯示AIBI在許多生物學過程中起重要作用，如細胞的增殖、遷移、分化、性成熟以及一些癌癥的發(fā)生發(fā)展。但是，目前關于AIBI功能的作用機制還知之甚少。在人上皮性腫瘤進展過程中，AIB1是SRC家族中唯一擴增和高表達的成員，它能增強三苯氧胺的雌激素樣作用。AIB1還是重要的ER輔助激活因子，在轉基因動物模型中高表達時，具有促進腫瘤形成的作用。AIB1丟失后通過抑制受體的降解和滅活轉錄的啟動而影

8、響ER的信號途徑。作為ER的輔助激活因子，AIB1只在ER陽性的乳腺癌細胞系中表達，而在ER陰性的乳腺癌細胞系中均不表達。臨床研究也證實AIB1普遍存在于ER陽性的腫瘤中。而且，AIB1與ERα成正相關，與ERβ成負相關。 激素依賴性乳腺癌中，E與ER結合是促進乳腺癌增殖作用的主要途徑，然而除了E-ER信號途徑之外，EGFR家族的信號途徑也是乳腺癌發(fā)病的另一個重要機制。HER2作為EGFR家族的重要成員之一，是廣泛應用于臨床的預

9、測乳腺癌患者內分泌治療和腫瘤復發(fā)的腫瘤標記物。Kent Osborne等已證實AIB1和HER2共同作用降低三苯氧胺對乳腺癌病人的療效。他們對316例乳腺癌患者術后進行長期隨訪，發(fā)現(xiàn)沒用三苯氧胺治療的AIB1高表達的乳腺癌患者預后較好，無病生存期較長。相反，接受三苯氧胺治療的AIB1高表達的乳腺癌患者無病生存期短。研究結果表明AIB1和三苯氧胺之間存在密切的相互作用。另有研究表明在AIB1和HER2高表達的乳腺癌患者中，HER2通過激活

10、MAPK，而使AIB1和ER磷酸化，導致三苯氧胺的抗雌激素作用明顯減弱，而雌激素作用增強，從而導致耐藥。這不僅使三苯氧胺的抗腫瘤作用消失，而且因三苯氧胺的雌激素作用還加快了腫瘤的生長。最近報道AIB1在HER1-3陽性的乳腺癌中表達可以預測乳腺癌的早期復發(fā)和死亡。這對乳腺癌的內分泌治療及預后具有重要的指導意義。 這些研究均表明AIB1在乳腺癌抗雌激素治療耐藥中發(fā)揮重要作用。然而，到目前為止人們還沒有弄清楚AIB1是如何將三苯氧胺

11、的雌激素拮抗作用轉為激活作用的。本課題的目的就是為了闡明在AIB1和HER2高表達的雌激素受體陽性的乳腺癌中三苯氧胺的耐藥機制。我們研究了在雌激素受體陽性的腫瘤細胞中AIB1對三苯氧胺誘導的雌激素樣作用，從而為其臨床應用提供試驗基礎。 第一部分：AIB1基因的RNAi真核表達載體的構建及鑒定 目的: 利用RNA干擾技術，構建針對AIB1的shRNA真核表達載體。 方法: （1）根據(jù)AIB1特異的si

12、RNA序列和陰性對照干擾序列合成相應的4條寡核苷酸； （2）將兩兩互補的四條寡核苷酸鏈進行磷酸化，并退火連接形成互補的雙鏈； （3）將質粒pGenesil-1-U6用BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，使其線性化； （4）用T4 DNA連接酶將互補的siRNA模板鏈與線性化的質粒載體連接； （5）用大腸桿菌DH5α制備感受態(tài)細胞，將連接好的重組質粒轉化到感受態(tài)細胞內； （6）擴增大腸桿菌，用質粒提取試劑盒提取細菌

13、內的質粒； （7）提取到的質粒DNA用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計測其濃度和純度； （8）重組質粒用SalI酶切鑒定，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖凝膠電泳； （9）將經(jīng)酶切鑒定的陽性菌液收集1ml，交由武漢晶賽生物技術公司行DNA測序。 結論: 成功構建了目的基因pGenesil-shAIB1和陰性對照pGenesil-shControl的質粒表達載體。 第二部分：AIB1在ER陽性的乳腺癌細胞中對三苯氧

14、胺耐藥的作用機制 目的: （1）研究AIB1的RNAi表達載體在BT474乳腺癌細胞中對AIB1基因的抑制作用； （2）觀察RNAi沉默AIB1基因表達后，乳腺癌BT474細胞生物學行為的變化，并通過測定一些腫瘤標記物的表達水平，探討AIB1在ER陽性乳腺癌細胞中對三苯氧胺耐藥的作用機制。 方法: （1）常規(guī)培養(yǎng)人乳腺癌BT474細胞，利用Lipofectamine2000將pshAIB1載體和pshC

15、ontrol載體轉染入BT474細胞中，用G418篩選出穩(wěn)定表達AIB1 shRNA的細胞株； （2）用RT-PCR和Western blot法檢測BT474/shAIB1和BT474/shControl細胞中AIB1 mRNA和蛋白的表達水平； （3）臺盼藍拒染測定BT474/shAIB1和BT474/shControl細胞的的增殖情況，并繪制細胞生長曲線； （4）測定MCF-7，BT474，BT474/shAIB1

16、和BT474/shControl四種細胞在不同濃度的Tam刺激下的增殖情況，以確定各細胞對Tam的敏感性；并檢測干擾前后細胞對E2的敏感性變化； （5）流式細胞儀檢測BT474/shAIB1和BT474/shControl細胞在激素和無激素環(huán)境中細胞周期的分布情況； （6）Western blot檢測BT474細胞在干擾前后及Tam和E2刺激下AIB1，ERα，HER2和pS2蛋白的表達變化。 結論: （1）

17、構建的AIB1 RNAi表達載體經(jīng)證實對乳腺癌BT474細胞中的AIB1mRNA及蛋白的表達具有干擾效應； （2）AIB1基因與乳腺癌BT474細胞的增殖密切相關，并且是激素非依賴性的；AIB1刺激細胞增殖的作用，部分是通過加快細胞周期的進程而實現(xiàn)的。 （3）在AIB1和HER2高表達的ER陽性的乳腺癌BT474細胞中；三苯氧胺表現(xiàn)為雌激素激動劑作用，從而導致了原發(fā)耐藥；AIB1受抑制后能夠消除這種雌激素激動劑作用，從而恢復