PAX2及AIB1基因在乳腺癌他莫昔芬耐藥機(jī)制中的作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:
　　乳腺癌是全球女性最常見的惡性腫瘤，嚴(yán)重危害著女性的生命和健康。近年來(lái)我國(guó)乳腺癌的發(fā)病率持續(xù)上升，且發(fā)病年齡呈年輕化。內(nèi)分泌治療以其副作用小、效應(yīng)持久，成為乳腺癌最重要的治療手段之一。他莫昔芬是一種選擇性雌激素受體調(diào)變劑，用于絕經(jīng)前雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌患者的內(nèi)分泌治療。目前臨床上約40％雌激素受體(estrogen receptor,ER)陽(yáng)性的乳腺癌患者對(duì)抗雌激素治療產(chǎn)生耐藥，而具體機(jī)制尚不明確。
　　PAX2

2、基因定位于人類10號(hào)染色體長(zhǎng)臂的2區(qū)4帶(10q24)，其編碼成對(duì)基因盒2，其最早從果蠅中發(fā)現(xiàn)，被認(rèn)為是抑癌基因WTI的轉(zhuǎn)錄抑制因子。前期的回顧性研究表明，配對(duì)盒基因(PAX2)和AIB1與HER2的表達(dá)水平相關(guān)，而抗雌激素治療的代表藥物他莫昔芬耐藥的乳腺腫瘤特征為HER2高表達(dá);目前有關(guān)PAX2和AIB1在乳腺癌內(nèi)分泌治療耐藥機(jī)制中的研究鮮有報(bào)道。鑒于此，本文對(duì)PAX2和AIB1在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)及其調(diào)控HER2表達(dá)

3、的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了較為系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)研究，為他莫昔芬耐藥機(jī)制的相關(guān)研究提供了分子生物學(xué)基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1細(xì)胞培養(yǎng)與處理
　　本實(shí)驗(yàn)采用人乳腺癌MCF-7和MCF7/TAMR2種細(xì)胞株。人乳腺癌MCF-7細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)在含有10％胎牛血清、100U/L青鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中，置于含5％CO2的37攝氏度恒溫恒濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。采用4-OHTAM長(zhǎng)期暴露法誘導(dǎo)出人乳腺癌MCF7/TAMR亞型，其培養(yǎng)條件同MCF

4、-7細(xì)胞。分別給予溶劑對(duì)照（0.01％的無(wú)水乙醇）及1μM的TAM處理24h。9nM針對(duì)HER2的抑制劑Lapatinib預(yù)處理0.5h。
　　2 siRNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染
　　分別用100pmol陰性對(duì)照NC siRNA和PAX2 siRNA轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞24h后，再給予1μMTAM處理24h，同法將AIB1 siRNA轉(zhuǎn)染MCF7/TAMR進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究。分別用1μg表達(dá)AIB1的質(zhì)粒和作為陰性對(duì)照的空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF-

5、7細(xì)胞中，再給予1μMTAM處理24h，同法將PAX2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7/TAMR細(xì)胞并處理。
　　3蛋白免疫印跡(Western blot)
　　提取細(xì)胞總蛋白，用蛋白免疫印跡方法檢測(cè)各蛋白的表達(dá)情況，再通過(guò)Odyssey成像系統(tǒng)進(jìn)行顯色并分析數(shù)據(jù)。
　　4實(shí)時(shí)定量PCR(Quantitative Real-time PCR)
　　提取細(xì)胞的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)人乳腺癌MCF-7和MCF

6、7/TAMR細(xì)胞中AIB1、PAX2、HER2 mRNA表達(dá)情況，并用Gene Amp PCR系統(tǒng)進(jìn)行分析。
　　5 MTT比色法測(cè)定細(xì)胞增殖
　　siRNA或質(zhì)粒轉(zhuǎn)染再給予TAM處理后，分別收集各組細(xì)胞，用MTT處理后利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定各個(gè)孔在570nm處的OD值，來(lái)反應(yīng)細(xì)胞增殖情況。
　　6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　采用SPSS(13.0)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，兩均數(shù)比較的t檢驗(yàn)分析和單因素方差分析(analysis o

7、f variance，ANOVA)，數(shù)據(jù)用(x)±SD表示，每組實(shí)驗(yàn)不少于3次獨(dú)立樣本的重復(fù)，檢驗(yàn)以P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　結(jié)果:
　　1 PAX2、AIB1、HER2在人ER陽(yáng)性乳腺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況
　　Western bolt檢測(cè)結(jié)果表明，PAX2、AIB1、HER2蛋白在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌MCF-7及MCF7/TAMR細(xì)胞中均表達(dá)。在MCF-7細(xì)胞的兩種亞型中，MCF7/TAMR細(xì)胞中PAX2

8、蛋白的相對(duì)表達(dá)量低于野生型MCF-7細(xì)胞，而HER2蛋白表達(dá)較高，二者AIB1表達(dá)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2TAM處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖及AIB1、PAX2及HER2蛋白表達(dá)的影響
　　2.1 TAM處理對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖的影響
　　MTT分析結(jié)果:隨著TAM濃度的升高，MCF-7細(xì)胞增殖逐漸降低;而低濃度TAM對(duì)MCF7/TAMR細(xì)胞呈現(xiàn)出刺激增值的作用，高濃度TAM呈現(xiàn)出抑制作用。
　　2.21μM TAM處理MCF-7和M

9、CF7/TAMR細(xì)胞對(duì)AIB1、PAX2及HER2蛋白表達(dá)情況的影響
　　TAM處理前后，在MCF-7細(xì)胞中，TAM刺激后AIB1表達(dá)顯著升高，PAX2、HER2表達(dá)降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。而在MCF7/TAMR細(xì)胞中，TAM刺激使得HER2、PAX2、AIB1蛋白表達(dá)均無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。
　　3 PAX2在乳腺癌中的生物學(xué)功能研究
　　3.1利用siRNA干擾技術(shù)，體外觀察PAX2在乳腺

10、癌中的作用
　　3.1.1沉默PAX2對(duì)TAM刺激下MCF-7細(xì)胞HER2、AIB1表達(dá)的影響
　　Real-time PCR結(jié)果顯示，在MCF-7細(xì)胞中，PAX2 siRNA+TAM處理組細(xì)胞中HER2 mRNA的表達(dá)水平與PAX2 siRNA+Vehicle處理組無(wú)顯著差異(P＞0.05）。Western blot結(jié)果顯示，與PAX2 siRNA+Vehicle組相比，PAX2 siRNA+TAM組中HER2在蛋白水平上

11、的相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著差異(P＞0.05)。結(jié)果提示，PAX2基因的沉默消除了TAM引起的MCF-7細(xì)胞HER2轉(zhuǎn)錄抑制和HER2蛋白表達(dá)降低。
　　在MCF-7細(xì)胞中，沉默PAX2之后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，加入TAM處理后，PAX2 siRNA+TAM組中AIB1蛋白與PAX2siRNA+Vehicle組相比表達(dá)水平降低(P＜0.05）。
　　3.1.3沉默PAX2基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞TAM治療敏感性的影響

12、>　　MTT檢測(cè)結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染PAX2 siRNA，再給予TAM處理后24小時(shí)后，可見細(xì)胞增殖活性較PAX2+Vehicle組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。使用針對(duì)HER2的特異性阻斷劑拉帕替尼預(yù)處理后，MCF-7細(xì)胞沉默PAX2給予TAM處理后較未給予拉帕替尼處理的細(xì)胞細(xì)胞增殖明顯受到抑制。
　　3.2利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)PAX2，體外觀察其在乳腺癌中的作用
　　3.2.1過(guò)表達(dá)PAX2對(duì)TAM刺激下M

13、CF7/TAMR細(xì)胞HER2、AIB1表達(dá)的影響
　　Real time-PCR結(jié)果顯示:PAX2質(zhì)粒+TAM處理組細(xì)胞中HER2mRNA的表達(dá)水平與PAX2質(zhì)粒+Vehicle處理組相比明顯減低。Westernblot檢測(cè)結(jié)果顯示，與空載質(zhì)粒+TAM組相比，PAX2質(zhì)粒+TAM組中HER2在蛋白水平上的相對(duì)表達(dá)量明顯減低。
　　在MCF7/TAMR細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染進(jìn)外源性PAX2之后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，不

14、同于MCF7/TAMR細(xì)胞，加入TAM處理后，PAX2質(zhì)粒+TAM組較PAX2+Vehicle組AIB1蛋白的相對(duì)表達(dá)量減少。
　　3.2.2過(guò)表達(dá)PAX2基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞TAM治療敏感性的影響
　　MTT檢測(cè)結(jié)果表明，MCF7/TAMR細(xì)胞給予TAM處理前后細(xì)胞生長(zhǎng)加快;MCF7/TAMR細(xì)胞給予PAX2質(zhì)粒+TAM處理后24小時(shí)，可見細(xì)胞增殖活性低于PAX2+Vehicle細(xì)胞(P＜0.05)。
　　4 AIB1在

15、乳腺癌中的生物學(xué)功能研究
　　4.1利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)過(guò)表達(dá)AIB1，體外觀察其在乳腺癌中的作用
　　4.1.1過(guò)表達(dá)AIB1對(duì)TAM刺激下MCF-7細(xì)胞HER2、PAX2表達(dá)的影響
　　Real time-PCR結(jié)果顯示:AIB1質(zhì)粒+TAM處理組細(xì)胞中HER2mRNA的表達(dá)水平與AIB1質(zhì)粒+Vehicle組相比明顯增高。Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，AIB1質(zhì)粒+TAM處理組細(xì)胞中HER2蛋白的表達(dá)水平與A

16、IB1質(zhì)粒+Vehicle組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　在MCF-7細(xì)胞系中，轉(zhuǎn)染進(jìn)外源性AIB1之后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，AIB1質(zhì)粒+TAM處理組細(xì)胞中PAX2蛋白與Vector+TAM處理組相比表達(dá)增加。
　　4.1.2過(guò)表達(dá)AIB1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞TAM治療敏感性的影響
　　MTT檢測(cè)結(jié)果表明，MCF-7細(xì)胞給予AIB1質(zhì)粒+TAM組處理后24小時(shí)，可見細(xì)胞增殖活性較AIB1質(zhì)

17、粒+Vehicle組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而針對(duì)HER2的抑制劑拉帕替尼預(yù)處理后，細(xì)胞增殖活性受到抑制。
　　4.2利用siRNA干擾技術(shù)，體外觀察AIB1在乳腺癌中的作用
　　4.2.1沉默AIB1對(duì)TAM刺激下MCF7/TAMR細(xì)胞HER2、PAX2表達(dá)的影響
　　Real-time PCR結(jié)果顯示，在MCF7/TAMR細(xì)胞中TAM對(duì)HER2表達(dá)無(wú)明顯影響，而MCF7/TAMR細(xì)胞中沉默AIB1恢復(fù)了TAM下調(diào)HER2

18、轉(zhuǎn)錄的作用。Western blot結(jié)果顯示，與AIB1 siRNA+Vehicle組相比，AIB1siRNA+TAM組中HER2在蛋白水平上的相對(duì)表達(dá)量降低。
　　在MCF7/TAMR細(xì)胞中，沉默AIB1之后，Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與AIB1 siRNA+Vehicle組相比，AIB1 siRNA+TAM組中PAX2蛋白表達(dá)水平升高。
　　4.2.3沉默MB1基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞TAM治療敏感性的影響
　

19、　MTT檢測(cè)結(jié)果表明，MCF7/TAMR細(xì)胞轉(zhuǎn)染AIB1 siRNA后，細(xì)胞增殖活性降低;通過(guò)siRNA抑制AIB1表達(dá)后，恢復(fù)了MCF7/TAMR對(duì)TAM的敏感性。
　　結(jié)論:
　　1 PAX2、AIB1在雌激素受體陽(yáng)性的乳腺癌細(xì)胞中均表達(dá)，在HER2高表達(dá)的TAM耐藥株中PAX2表達(dá)較TAM敏感的細(xì)胞株低，而二者AIB1表達(dá)水平相當(dāng)。
　　2 PAX2過(guò)表達(dá)增加乳腺癌細(xì)胞對(duì)TAM的敏感性，AIB1過(guò)表達(dá)則減低了其敏