N-MYC下游調(diào)節(jié)基因2(NDRG2)對(duì)膀胱癌增殖及轉(zhuǎn)移作用的研究.pdf

1、研究背景及目的:
　　膀胱癌是我國(guó)泌尿外科臨床上最常見的惡性腫瘤之一,占全部惡性腫瘤的1％-2%,其發(fā)病率與死亡率均占泌尿系腫瘤的首位,是一種直接威脅患者生存的疾病。近年來,我國(guó)膀胱癌發(fā)病率呈增長(zhǎng)趨勢(shì)。膀胱癌初診患者中70-80%為淺表性腫瘤(臨床分期Ta-T1)。目前臨床上治療膀胱癌主要以手術(shù)為主,輔以膀胱內(nèi)灌注化療及生物制劑治療。膀胱癌的轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)是膀胱腫瘤患者致死的主要原因之一。雖然目前臨床可以很好的控制膀胱癌,但是其5年復(fù)

2、發(fā)率高達(dá)26–44%(T4),40–64%(T3),52–77%(T2)。系統(tǒng)性化療主要是針對(duì)肌肉浸潤(rùn)性和轉(zhuǎn)移性膀胱癌的首選治療方案,系統(tǒng)化療能改善進(jìn)展期或轉(zhuǎn)移性膀胱癌的預(yù)后,延長(zhǎng)患者生存時(shí)間。但是以MVAC(甲氨蝶呤、長(zhǎng)春堿、多柔比星、順鉑)和GC(吉西他濱、順鉑)方案為代表的膀胱癌聯(lián)合化療方案具有毒副作用大、長(zhǎng)期預(yù)后欠佳等不足。所以發(fā)現(xiàn)新的膀胱癌診斷及治療方法變得尤為重要,而基因治療是近年來研究的非常多的一種診斷治療方法。
　

3、　NDRG2是N-MYC下游調(diào)節(jié)基因(N-myc Downstream Regulated Gene,NDRG)家族的重要成員之一,人源NDRG2是我校生化教研室首先發(fā)現(xiàn)并被命名的(AF159092),它最初是在N-Myc基因敲除小鼠中發(fā)現(xiàn)的,隨著對(duì)其研究及其機(jī)制的不斷深入,NDRG2在多種不同類型的腫瘤中表達(dá)水平較正常組織是降低的,例如:前列腺癌、肝癌、胃癌、乳腺癌及腎癌等,且與正常組織的NDRG2蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。這些研究說明了ND

4、RG2對(duì)腫瘤起著一定的抑制作用。并且,最新的研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)NDRG2可以抑制肝癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移以及乳腺癌的淋巴節(jié)轉(zhuǎn)移,上調(diào)NDRG2表達(dá)后,在動(dòng)物體內(nèi),可發(fā)現(xiàn)其抑制前列腺癌的骨轉(zhuǎn)移。這些證據(jù)均表明,NDRG2在腫瘤的形成中發(fā)揮著重要的作用,NDRG2可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等。
　　目前NDRG2基因在泌尿系腫瘤中的前列腺癌和腎細(xì)胞癌中被證實(shí)具有抑制癌細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移的作用,但是在膀胱癌表達(dá)方面未見相關(guān)的研究報(bào)道,因此本研究旨在進(jìn)一

5、步探討該基因在膀胱腫瘤組織中的表達(dá)情況,以及NDRG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖、凋亡以及轉(zhuǎn)移的影響,為臨床診斷和治療膀胱癌提供一定的依據(jù)。
　　研究方法及內(nèi)容:
　　本研究通過檢測(cè)NDRG2在正常膀胱組織和腫瘤中表達(dá)水平,觀察其對(duì)人膀胱癌增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移能力的影響。初步了解NDRG2在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中的作用。本研究包括以下三方面內(nèi)容:
　　1.應(yīng)用免疫組化方法檢測(cè)NDRG2在膀胱組織中表達(dá)情況以及與c-Myc之間表達(dá)的關(guān)系

6、。
　　采用免疫組織化學(xué)方法對(duì)112例膀胱(15例膀胱正常組織,97例膀胱腫瘤組織)組織標(biāo)本進(jìn)行S-P法染色,然后顯微鏡下觀察染色情況,檢測(cè)NDRG2在膀胱正常組織和膀胱腫瘤組織中的表達(dá)差異情況,以及NDRG2與c-Myc、臨床病理分期、年齡和性別之間的相關(guān)性。
　　2.慢病毒介導(dǎo)的NDRG2基因?qū)Π螂装┘?xì)胞在體外的增殖、凋亡以及侵襲轉(zhuǎn)移的影響。
　　我們以攜帶人源NDRG2基因的慢病毒載體感染體外培養(yǎng)的T24細(xì)胞系。

7、運(yùn)用PCR和Western-blot方法檢測(cè)目的基因在膀胱癌T24細(xì)胞的表達(dá)水平,通過平板克隆實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)病毒介導(dǎo)的過表達(dá)NDRG2對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖能力的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)感染前后膀胱癌細(xì)胞周期、凋亡的變化有無差異。同時(shí),慢病毒感染后高表達(dá)的NDRG2對(duì)于周期和凋亡相關(guān)蛋白(cyclinD1,CDK4,p21)以及對(duì)膀胱癌轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP-2,MMP-9)表達(dá)水平的影響,以及Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)NDRG2對(duì)T24

8、細(xì)胞在體外對(duì)遷移和轉(zhuǎn)移能力的影響。
　　3.NDRG2基因過表達(dá)對(duì)于膀胱癌細(xì)胞體內(nèi)增殖、凋亡及轉(zhuǎn)移的影響。
　　同周齡雄性裸鼠隨機(jī)分為兩組,每組5只,將慢病毒介導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)組LEN-NDRG2細(xì)胞及對(duì)照組LEN-Lacz細(xì)胞在裸鼠腋下注射成瘤,然后檢測(cè)腫瘤生長(zhǎng)曲線,腫瘤大小達(dá)到300mm3后,脫頸法處死裸鼠,檢測(cè)瘤體生長(zhǎng)比率以及有無淋巴結(jié)的轉(zhuǎn)移等,腫瘤組織提取蛋白,檢測(cè)腫瘤周期凋亡相關(guān)蛋白(cyclinD1,CDK4,p21)和

9、轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白(MMP-2,MMP-9)的表達(dá)水平兩組之間有無差異。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果:
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明NDRG2在膀胱腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率和表達(dá)水平均低于膀胱正常組織(χ2=8.761,p<0.01),并且NDRG2的表達(dá)與病理組織病理分級(jí)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.248,p<0.05),這提示NDRG2可能與膀胱腫瘤的組織病理分期有一定的相關(guān)性,而與性別、年齡無明顯相關(guān)性;且NDRG2與c-myc表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(-0.454,p<

10、0.001)。膀胱癌細(xì)胞系中的NDRG2蛋白和mRNA的表達(dá)水平均低于正常膀胱上皮細(xì)胞,尤以T24最低。慢病毒感染T24細(xì)胞,穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系構(gòu)建成功,NDRG2過表達(dá)可以抑制T24細(xì)胞的增殖、促進(jìn)凋亡,并且對(duì)膀胱癌T24細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力有一定的抑制作用,體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)結(jié)論相同。
　　結(jié)論與提示:
　　NDRG2可能參與了膀胱癌的發(fā)生和發(fā)展,膀胱癌中NDRG2低表達(dá),我們通過慢病毒感染使NDRG2過表達(dá),可以抑制膀胱癌T24細(xì)