玉米磷酸乙醇胺氮甲基轉(zhuǎn)移酶(PEAMT)基因啟動(dòng)子的克隆和功能分析.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、甜菜堿是一種無毒滲透保護(hù)劑,在非生物脅迫條件下大量積累來維持細(xì)胞的滲透壓,保證植物的正常生長。磷酸乙醇胺氮甲基轉(zhuǎn)移酶(phosphoethanolamine methyltransferase,PEAMT)作為甜菜堿合成的關(guān)鍵酶,其基因表達(dá)受上游啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)。目前關(guān)于玉米(Zea mays L.)內(nèi)源PEAMT基因啟動(dòng)子的研究較少。本研究以玉米自交系B73(cv.B73)為材料,根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(national center for

2、 biotechnology information)中玉米PEAMT基因序列設(shè)計(jì)引物,利用普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction,PCR)克隆其上游5'側(cè)翼序列。通過構(gòu)建含有玉米PEAMT啟動(dòng)子全長和缺失片段融合β-葡萄糖苷酸酶報(bào)告基因(GUS)的表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草(Nicotiana benthamianaL.),利用組織化學(xué)染色和GUS酶活性分析確定PEAMT基因啟動(dòng)子全長和不同缺失片段響應(yīng)干旱(1

3、5%PEG-6000,m/v)、鹽(100mmol·L-1NaCl)、低溫(4℃)和氧化脅迫(100mmol·L-1H2O2)等非生物脅迫的能力。主要研究結(jié)果如下:
  1.根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫玉米PEAMT基因序列設(shè)計(jì)引物,克隆了PEAMT啟動(dòng)子序列,序列長度為1048bp(序列信息詳見附錄一)。利用在線預(yù)測軟件Promoter prediciton、PLACE和PlantCare預(yù)測出該序列中存在17個(gè)非脅迫應(yīng)答順式作用元件、1

4、3個(gè)光誘導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)元件、9個(gè)激素應(yīng)答順式作用元件以及5個(gè)花粉發(fā)育特異性激活元件等。
  2.構(gòu)建了PEAMT基因啟動(dòng)子融合GUS報(bào)告基因表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化煙草,發(fā)現(xiàn)克隆得到的PEAMT基因啟動(dòng)子能夠驅(qū)動(dòng)GUS基因的高效表達(dá)。經(jīng)過GUS酶活性分析,PEAMT基因啟動(dòng)子呈正調(diào)控表達(dá)模式,在干旱、鹽、低溫和氧化脅迫下的活性分別為27.4、39.9、23.5和19.7nmol4-MU·min-1·mg-1protein,與對照(3.44nmo

5、l4-MU·min-1·mg-1protein)相比分別提高了1.64倍、2.84倍、1.47倍和3.59倍。
  3.進(jìn)一步對該啟動(dòng)子進(jìn)行5'端缺失分析,克隆了4種不同長度的5'端缺失片段,序列長度分別為826bp(P2)、642bp(P3)、428bp(P4)和245bp(P5)。將這些啟動(dòng)子片段與GUS報(bào)告基因融合構(gòu)建表達(dá)載體,獲得含有不同缺失啟動(dòng)子片段的陽性轉(zhuǎn)化植株。GUS組織化學(xué)染色結(jié)果表明,4種啟動(dòng)子缺失片段均具有表達(dá)

6、活性。GUS酶活性結(jié)果表明,不同類型的非生物脅迫均能誘導(dǎo)不同缺失片段啟動(dòng)子活性的增加。其中,P3片段啟動(dòng)子在干旱和低溫脅迫條件下的表達(dá)量均相對較高,分別為37.18和19.76nmol4-MU·min-1·mg-1protein,與對照相比分別增加了4.76倍和5.33倍;P4片段啟動(dòng)子在鹽脅迫處理下的表達(dá)量較高,為36.46nmol4-MU·min-1·mg-1protein,與對照相比增加了6.12倍;P2片段啟動(dòng)子在氧化脅迫下的表

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