天仙子氮甲基腐胺轉移酶(PMT)基因啟動子的克隆及功能分析.pdf

1、茄科植物天仙子（Hyoscyamus niger L.）,是一類能夠產生托品烷生物堿（tropane alkaloids，TAs）的重要藥用植物，其中莨菪堿、東莨菪堿是被廣泛使用的抗膽堿制劑。近年來，代謝工程的興起使得遺傳改造TAs生物合成途徑成為可能，而代謝工程依賴于對該途徑的分子生物學和生物化學研究。高等植物功能基因的轉錄翻譯特點與其調控機制一直是植物基因工程領域比較熱門的研究方向。對植物啟動子的研究有助于了解基因轉錄調控表達模式及

2、其調控機制，并應用于基因工程中提高或改進外源目的基因的表達。啟動子按其轉錄方式的不同可以分為組成型啟動子、組織特異性啟動子和誘導型啟動子。組成型啟動子驅動外源基因的組成型表達往往會造成資源的浪費，同時異源蛋白的過量積累也會造成植物代謝紊亂，不能正常生長。因此研究組織特異性啟動子和誘導型啟動子更具有價值。
　　茉莉酸（jasmonie acid,JA）及其甲酯（methyl jasmonate,MeJA）是重要的信號轉導分子，JA、

3、MeJA及其他JA衍生物統(tǒng)稱為茉莉酸類（jasmonates，JAs）。這些信號分子影響各種植物過程,包括傷害,非生物脅迫,防御昆蟲和寄生的病原體。此外JAs還能夠在轉錄水平上影響植物次生代謝。
　　MeJ A作為誘導子影響次生代謝物合成的研究越來越受到人們的關注。就目前為止，國內外已有大量的關于 JAs誘導產生植物次生代謝物的報道，這些研究多數是結合基因工程、功能基因組等分子生物學技術進行研究。本研究以天仙子為試驗材料，研究氮甲

4、基腐胺轉移酶基因的啟動子，旨在闡明啟動子不同區(qū)域發(fā)揮的功能，及其初步探索啟動子對MeJ A的響應情況。利用high-efficiency TAIL-PCR(hiTAIL-PCR)方法克隆了HnPMT基因的啟動子，將啟動子及用PCR方法獲得的一系列5＇端缺失片段與報告基因GUS融合，轉化擬南芥和天仙子發(fā)根，利用50μM MeJA處理天仙子發(fā)根，發(fā)現該啟動子受MeJA的誘導。對各個不同截短長度啟動子的轉基因擬南芥幼苗進行GUS染色及轉基因發(fā)

5、根的GUS染色石蠟切片分析，發(fā)現該啟動子是根特異性啟動子。主要研究結果如下：
　　1.根據HnPMT基因5＇端非編碼區(qū)設計特異性引物，利用hiTALL-PCR的方法，克隆了長1207bp的HnPMT基因啟動子(KU981110)。利用啟動子分析網站在線預測，ATG位于轉錄起始位點下游79bp處。在轉錄起始位點上游-30/-25區(qū)有一個TATA-box（TATAAA），在轉錄起始位點上游-254/-359區(qū)存在多個CAAT-box，

6、都是真核植物啟動子具有的特征元件。同時又發(fā)現了參與茉莉酸甲酯響應的元件，如CGTCA-motif，TGACG-mitif和 G-box；激素響應元件如AuxRR-core；SA響應元件如TCA-element；參與防御基因激活的調控元件，如MBS，TC-rich repeats，W-box，HSE，LTR.；光響應元件如Box4，Box I site，ATCC-motif，GAG-motif。Gap-box，Sp1等，ROOTMOTIF

7、TAPOX1，OSE2ROOTNODULE，OSE1ROOTNODULE和NTBBF1ARROLB是與根特異性有關的順勢作用元件。
　　2.將克隆到的HnPMT最長啟動子（-1128/+79）、各缺失啟動子（-701/+79、-451/+79、-217/+79）及 G-box突變啟動子構建到植物雙元表達載體 pCAMBIA1391Z載體上，產物命名為pCAM-HnPMT217、 pCAM-HnPMT451、 pCAM-HnPMT7

8、01、 pCAM-HnPMT1128、pCAM-HnPMT217-muG-box，并采用農桿菌介導法，轉化擬南芥和天仙子發(fā)根。成功獲得轉基因擬南芥植株AP217、AP451、AP701、AP1128，轉基因天仙子發(fā)根 HR217、HR451、HR701、HR1128、HR217-muG-box，為后續(xù)進行該啟動子功能的研究提供試驗材料。
　　3.對天仙子植株的實時熒光定量結果表明，HnPMT基因主要在根中表達，葉片中幾乎不表達。進

9、一步對轉基因擬南芥進行GUS組織化學染色，分析結果表明：AP217、AP451和AP701的組織化學染色，該三種不同長度的啟動子驅動的報告基因GUS，在擬南芥的葉片和根中都有表達，沒有表現出組織特異性，AP1128的染色結果表明-1128/+79區(qū)段的啟動子能夠驅動報告基因GUS特異的在根中表達，而在葉片不表達。因此，HnPMT啟動子特異性在根中表達，并且在啟動子-1128/-701區(qū)之間存在根特異性元件。對天仙子發(fā)根的GUS組織化學染

10、色和石蠟切片的分析：在所有的轉基因發(fā)根中，發(fā)根的根尖和表皮層部位都沒有GUS的表達，HR217、HR451和 HR701發(fā)根中該三種長度的啟動子驅動的報告基因GUS，在根的皮層、內皮層和維管組柱表達，HR1128發(fā)根GUS切片結果表明-1128/+79區(qū)段的啟動子能夠驅動報告基因GUS，在天仙子發(fā)根的內皮層和維管柱表達，而在皮層不表達。因此推斷，在 HnPMT啟動子的-1128/-701區(qū)段有某些作用元件調控這一現象。
　　4.對

11、在三角搖瓶培養(yǎng)了28天的天仙子空白發(fā)根用50μM MeJA處理，分別處理0h、1h、6h、12h、24h，實時熒光定量分析不同處理時間點HnPMT基因的相對表達量，結果表明在24h，基因對50μM MeJA的響應最厲害，此時間點基因的表達量最高。用同樣的方法處理轉基因發(fā)根，處理24h后測定報告基因GUS的相對活性，結果表明：HR217、HR451、HR701、HR1128轉基因發(fā)根都受到MeJA的誘導，因此HnPMT啟動子是一個受MeJ