柿果實(shí)品質(zhì)特性、香氣成分分析及醇?；D(zhuǎn)移酶基因(DkAAT1)的表達(dá)研究.pdf

1、柿(Diospyros kaki L.)屬于柿科(Ebenaceae)柿屬（Diospyros），是一種重要的商業(yè)和落葉果樹。中國(guó)是柿的起源國(guó)之一，也是世界上最大的柿生產(chǎn)國(guó)。雖然柿在不同的國(guó)家種植，并且由于其營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、健康效益和豐富的口味越來越受到人們的青睞，令人驚奇的是在風(fēng)味方面開展的研究很少，尤其是負(fù)責(zé)揮發(fā)性香氣合成的基因，而香氣被人們視為確定果實(shí)質(zhì)量和消費(fèi)者接受度的重要特征之一。在基因水平上通過對(duì)果實(shí)香氣的影響來評(píng)價(jià)揮發(fā)物是旨在提

2、高果實(shí)質(zhì)量的有用工具。最近在組學(xué)技術(shù)方面的進(jìn)展導(dǎo)致了編碼負(fù)責(zé)許多揮發(fā)物的生物合成的酶基因獲得分離，并且有助于我們對(duì)揮發(fā)性化合物形成相關(guān)調(diào)控機(jī)制的理解。在本研究中，柿果實(shí)被用作植物材料，以評(píng)估34種不同品種柿果實(shí)的主要品質(zhì)特征，并研究乙烯和水楊酸對(duì)“小方柿”和“奶油柿”兩個(gè)品種不同成熟階段主要品質(zhì)特征的影響。同時(shí)，我們也測(cè)定了兩個(gè)不同品種不同成熟階段的柿果實(shí)的芳香揮發(fā)性物質(zhì)。在此基礎(chǔ)上，對(duì)醇?；D(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了克隆和鑒定，并評(píng)價(jià)了乙烯和水

3、楊酸對(duì)“小方柿”和“奶油柿”不同成熟階段醇?；D(zhuǎn)移酶基因表達(dá)模式的影響。此外，通過轉(zhuǎn)錄組分析建立了柿果實(shí)轉(zhuǎn)錄序列數(shù)據(jù)庫，并鑒定了香氣生物合成相關(guān)的候選基因。主要研究結(jié)果如下:
　　1.甜柿品種平均單果重大于澀柿，而澀柿品種果形指數(shù)的差異大于甜柿品種。此外，澀柿品種的平均TSS高于甜柿，而甜柿和澀柿的TA基本一致。另一方面，結(jié)果表明，“小方柿”和“奶油柿”兩個(gè)品種不同成熟期的果實(shí)重量、果徑和果形指數(shù)等主要果實(shí)品質(zhì)指標(biāo)沒有顯著差異，而

4、果實(shí)硬度和TSS表現(xiàn)出明顯的差異。依稀處理的果實(shí)硬度和TSS最高，對(duì)照次之，而水楊酸處理的果實(shí)硬度和TSS最低。
　　2.不同柿品種的果實(shí)顏色比較表明，與甜柿相比，澀柿果皮和果肉顯示更深的橙紅色。此外，“小方柿”和“奶油柿”果實(shí)的色調(diào)角（H°）在采收的時(shí)候較高，然后在不同處理不同成熟階段均下降，表現(xiàn)為果實(shí)顏色橙色加深。
　　3.在8個(gè)甜柿和26個(gè)澀柿品種柿果實(shí)的頂空部分鑒定了許多不同的揮發(fā)性化合物，分別是48種和61種。通常

5、揮發(fā)性化合物因品種不同而變化。苯甲醛、環(huán)丙基甲醇、2-乙基-1-己醇、壬酮、β-紫羅蘭酮和乙酸龍腦酯是甜柿品種中最主要的醛類揮發(fā)物，而澀柿中產(chǎn)生的最主要的醛類揮發(fā)性成分是癸醛、2-乙基-1-己醇、β-紫羅蘭酮、壬酮、乙酸芐酯和乙酸龍腦酯。另一方面，己醛、環(huán)丙基甲醇、6-甲基-庚-5-烯-2-酮和乙酸乙酯，2-己烯醛、環(huán)丙基甲醇、壬酮、乙酸乙酯和乙酸丁酯分別是甜柿和澀柿中最豐富的揮發(fā)物。此外，在在“小方柿”和“奶油柿”不同成熟階段果肉的頂

6、空部分中分別鑒定出42種和34種不同的揮發(fā)性化合物。壬酸、(Z)-9-十六碳烯-1-醇、3-三癸醇、3-羥基-2-丁酮和芐基乙酸酯是不同成熟階段產(chǎn)生的最主要的揮發(fā)物。在“奶油柿”中，乙醛、壬醛、(Z)-9-十六碳烯-1-醇、芳樟醇、2-乙基-1-己醇和1-辛醇是不同成熟階段柿果中最主要的揮發(fā)物;而在不同成熟階段，3-羥基-2-丁酮是果實(shí)中唯一產(chǎn)生的酮類成分。
　　4.在定量的酯類成分中，結(jié)果表明，芐基乙酸酯是“小方柿”不同成熟階段

7、產(chǎn)生的最主要的酯，而乙酸乙酯和乙酸甲苯基苯酯則是“奶油柿”不同成熟階段產(chǎn)生的最主要的酯。另一方面，乙酸丁酯和乙酸乙酯均是兩個(gè)品種中產(chǎn)生的最豐富的酯類。一般來說，與其他處理相比，“小方柿”果實(shí)中醛類、酮類、酯類和酸類揮發(fā)性成分含量分別在處理后9d、15d、15d和12d最高，對(duì)照水果在處理后第15d為醇類含量最高。用水楊酸處理的“奶油柿”果實(shí)具有最高的醛類、醇類、酮類和酸類，而用乙烯處理的果實(shí)中產(chǎn)生的酯類最高。
　　5.通過將丁醇和

8、酰基-CoA轉(zhuǎn)化成相應(yīng)酯的能力來定量DkAAT蛋白質(zhì)的AAT活性。結(jié)果表明柿子果實(shí)不同成熟階段呈現(xiàn)不同變化趨勢(shì)。然而，在“小方柿”和“奶油柿”兩品種果實(shí)中，分別在水楊酸處理后第12d和第15d具有最高的AAT活性。
　　6.通過應(yīng)用具有特異性引物的3'-和5'-RACE策略來實(shí)現(xiàn)DkAAT1的克隆。3'-和5'-cDNA末端的剪接結(jié)果顯示，DkAAT1 cDNA全長(zhǎng)為1637 bp，包含ATG起始密碼子、1380 bp的開放閱讀框

9、（ORF）、TAA終止密碼子、75 bp的5'-非翻譯區(qū)(5'-UTR)，182 bp的3'-UTR和編碼459個(gè)氨基酸的poly(A)尾巴。此外，DkAAT1已在GenBank提交，登錄號(hào)為KP271995。利用GenBank BLAST進(jìn)行同源性分析，結(jié)果表明推導(dǎo)的氨基酸序列與其他植物編碼AAT的序列具有很高的相似性。另一方面，為了分析柿AAT家族的復(fù)雜性，使用Southern blotting進(jìn)行基因組分析。結(jié)果表明所有測(cè)試的限制

10、酶均存在一個(gè)拷貝的DkAAT基因。
　　7.通過RT-qPCR分析DkAAT1在不同組織器官及兩個(gè)不同品種成熟果實(shí)中的表達(dá)情況。結(jié)果表明，不同組織中表達(dá)差異顯著，在分析的不同組織中，花瓣顯示最高的轉(zhuǎn)錄本積累，其次是葉片，而果實(shí)顯示最低的轉(zhuǎn)錄本積累。通常，與“奶油柿”相比，DkAAT1基因在“小方柿”品種中高度表達(dá)，而且兩個(gè)品種果皮中表達(dá)水平均高于果肉。此外，試驗(yàn)還進(jìn)行了乙烯和水楊酸對(duì)兩個(gè)不同品種柿果實(shí)表達(dá)水平的影響，結(jié)果表明，在不

11、同成熟階段的所有果實(shí)中都觀察到轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的積累。然而，不同處理間在不同成熟階段的表達(dá)水平表現(xiàn)出顯著差異?？傮w來說，“小方柿”在成熟期間觀察到DkAAT1轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的顯著增加，乙烯處理果實(shí)、水楊酸處理果實(shí)分別在第9、12d達(dá)到最高水平，相對(duì)表達(dá)量分別為53.99和40.76。而“奶油柿”果實(shí)轉(zhuǎn)錄本在乙烯處理果實(shí)、水楊酸處理果實(shí)中，分別在第12、9d達(dá)到最高水平，相對(duì)表達(dá)量分別為31.73和5.08。
　　8.利用Illumina His

12、eqTM2000平臺(tái)對(duì)柿果實(shí)進(jìn)行從頭轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，結(jié)果表明從果肉cDNA文庫中產(chǎn)生84759380個(gè)原始閱讀文庫，獲得81973802個(gè)高質(zhì)量的干凈閱讀文庫，組裝成平均長(zhǎng)度為642 nt的71194個(gè)功能基因。KOG（真核細(xì)胞直系同源組）聚類分析顯示有26個(gè)不同的功能分類，其中最大的一組是預(yù)測(cè)的一般功能，然后是轉(zhuǎn)錄功能的一組。在GO（基因本體）分類中，功能分類中三個(gè)百分比最大的基因組分別是細(xì)胞過程、結(jié)合與代謝。隨后的KEGG（京都基因