甜瓜自交系再生與遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究及蔗糖磷酸合成酶（SPS）基因的全長cDNA克隆.pdf

1、甜瓜(CucumismeloL.)作為葫蘆科(Cucurbitaceae)植物中的一種重要的園藝作物，是全世界普遍栽培的重要水果，具有較高的商品價值和經(jīng)濟(jì)價值。隨著植物細(xì)胞工程和基因工程技術(shù)的迅速發(fā)展，應(yīng)用組織培養(yǎng)、基因轉(zhuǎn)化等技術(shù)手段進(jìn)行甜瓜品質(zhì)改良、提高抗逆性、創(chuàng)造新種質(zhì)，已成為甜瓜育種快速有效的新方法。為滿足生產(chǎn)需求而進(jìn)行組織快繁技術(shù)，目前多以生產(chǎn)雜交用種和引進(jìn)品種為材料進(jìn)行甜瓜組培再生。在轉(zhuǎn)基因方面，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法對WMV

2、、CMV、TMV病毒外殼蛋白的遺傳轉(zhuǎn)化也有成功的報道。由于雜交種的自交分離而難于應(yīng)用于遺傳育種，本試驗(yàn)以3個不同類型的甜瓜低糖自交系為試材，分別研究了再生、轉(zhuǎn)化體系中的主要影響因素；首次嘗試了花粉管通道技術(shù)在甜瓜遺傳轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用，并建立了相應(yīng)的早期快速篩選技術(shù)；成功克隆了影響果實(shí)糖代謝關(guān)鍵酶SPS基因的全長cDNA序列。主要試驗(yàn)結(jié)果如下： 1甜瓜自交系再生過程中主要影響因素的系統(tǒng)研究本試驗(yàn)以2個甜瓜低糖高代自交系烏克蘭(厚皮甜

3、瓜)、魯薄一號(薄皮甜瓜)為材料，分別研究了獲得高質(zhì)量無菌苗、外植體類型、無菌苗齡及外植體誘導(dǎo)分化、不定芽伸長生根培養(yǎng)基的激素組合等因素效應(yīng)，分析了6-BA、ZT、KT、2,4-D、GA、NAA、IAA、IBA等常用植物激素對甜瓜自交系再生轉(zhuǎn)化的影響，并通過器官直接發(fā)生途徑得到甜瓜不定芽。 試驗(yàn)結(jié)果表明，甜瓜種子無菌催芽后培養(yǎng)得到的無菌苗質(zhì)量最高；烏克蘭6d日齡、魯薄一號4d日齡的子葉柄外植體有利于誘導(dǎo)愈傷組織和不定芽，二者適宜

4、的分化培養(yǎng)基分別為MS+1.0mg/L6-BA+3.0-3.5mg/LZT+0.1mg/LNAA、MS+2.0-2.5mg/LBA+0.1mg/LNAA，再生頻率分別為45％-55％、50％-60％。6-BA、ZT是甜瓜自交系不定芽分化的主要細(xì)胞分裂素，ZT更有利于厚皮甜瓜的誘導(dǎo)分化；KT能夠誘導(dǎo)甜瓜自交系不定芽的發(fā)生，但后期再生植株上部生長點(diǎn)、新葉壞死，生根一般；2,4-D不能誘導(dǎo)不定芽，卻誘導(dǎo)了外植體發(fā)生不定根；KT、GA激素配比有

5、利于不定芽的伸長生長；IBA是較為理想的甜瓜生根激素。以器官直接發(fā)生途徑方式產(chǎn)生不定芽與誘導(dǎo)愈傷組織之間有一定的相關(guān)性，即只有誘導(dǎo)了高質(zhì)量的愈傷組織后才能分化不定芽，無愈傷及誘導(dǎo)了膨松白化愈傷組織的外植體不會分化不定芽。不定芽分化存在明顯極性現(xiàn)象，子葉柄的近軸端是誘導(dǎo)不定芽的敏感部位。 2應(yīng)用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)及花粉管通道法實(shí)現(xiàn)了3個甜瓜自交系的遺傳轉(zhuǎn)化以烏克蘭、魯薄一號優(yōu)化后的再生體系為基礎(chǔ)，分別研究了2個甜瓜自交系遺傳轉(zhuǎn)化過程中

6、的主要影響因素。通過梯度比較Kan選擇濃度、Cef抑菌濃度及外植體預(yù)培養(yǎng)時間、農(nóng)桿菌侵染時間、農(nóng)桿菌與外植體共培養(yǎng)條件等因素對不定芽分化的影響，優(yōu)化得到了烏克蘭、魯薄一號農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。試驗(yàn)結(jié)果表明，烏克蘭、魯薄一號分化誘導(dǎo)培養(yǎng)基中Kan選擇壓分別為100mg/L、75mg/L，且500mg/LCef可以抑制農(nóng)桿菌的生長；2個自交系的子葉柄在預(yù)培養(yǎng)基中分別培養(yǎng)3d、2d，Anti-MAIⅠ工程菌液(OD600=0.65)侵染6

7、min后轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基，烏克蘭采用光、暗交替共培養(yǎng)72h、魯薄一號暗培養(yǎng)60h后，轉(zhuǎn)入選擇培養(yǎng)基進(jìn)行抗性愈傷和不定芽的誘導(dǎo)分化。2個自交系的不定芽轉(zhuǎn)化率分別約為13.3％-20％、16.7％。 在調(diào)查3個甜瓜自交系花器結(jié)構(gòu)、花粉萌發(fā)特點(diǎn)前提下，應(yīng)用微量注射法、柱頭滴加法、混合授粉法進(jìn)行了反義MAI基因的轉(zhuǎn)化?；ǚ酃芡ǖ擂D(zhuǎn)化后植株坐瓜率降低、種子數(shù)量減少，癟籽增多。微量注射比柱頭滴加對植株坐瓜、結(jié)籽影響更大。 33個甜瓜自交

8、系轉(zhuǎn)基因植株的分子檢測及田間篩選對農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的烏克蘭、魯薄一號轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行MAI基因、Kanr基因NPT-Ⅱ的分子檢測。試驗(yàn)結(jié)果表明，甜瓜植株內(nèi)源AI基因嚴(yán)重干擾外源轉(zhuǎn)化MAI基因的檢測結(jié)果，繼續(xù)進(jìn)行與反義MAI基因連鎖的NPT-Ⅱ基因PCR擴(kuò)增，結(jié)果證明外源MAI基因的已經(jīng)整合進(jìn)甜瓜基因組。烏克蘭3個轉(zhuǎn)化不定芽擴(kuò)繁后得到11株轉(zhuǎn)基因植株，魯薄一號7個轉(zhuǎn)化不定芽擴(kuò)繁后得到27株轉(zhuǎn)基因植株。 通過藥用Kan處理3個甜瓜自交系

9、種子、子葉、真葉的反應(yīng)效果，篩選適宜的Kan臨界濃度并利用此濃度進(jìn)行花粉管通道法大量轉(zhuǎn)化種子的篩選。試驗(yàn)結(jié)果表明，烏克蘭Kan臨界濃度為種子1100mg/L、子葉4000mg/L、真葉3500mg/L；雪里華臨界濃度為種子800mg/L、子葉5000mg/L、真葉2500mg/L；魯薄一號臨界濃度為種子600mg/L、子葉2500mg/L、真葉2000mg/L。其中3個自交系均以子葉期Kan篩選準(zhǔn)確率最高，為40％左右，且不影響植株后期

10、生長。 通過對Kan抗性綠苗NPT-Ⅱ基因的PCR擴(kuò)增和PCR-Southern雜交結(jié)果表明，外源反義MAI基因通過花粉管通道法已經(jīng)整合進(jìn)3個甜瓜基因組中。烏克蘭、雪里華、魯薄一號3個自交系的花粉管通道法轉(zhuǎn)化率分別為0.30％、0.225％、0.25％。微量注射法轉(zhuǎn)化率高于柱頭滴加法，而子房頂端注射轉(zhuǎn)化率高于子房中位注射，柱頭重復(fù)滴加轉(zhuǎn)化率高于一次滴加。因此，利用花粉管通道法可以實(shí)現(xiàn)甜瓜外源基因的轉(zhuǎn)化。 4SPS基因全長