轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊dwf1的基因表達譜分析.pdf

1、鹽脅迫造成的鹽害首先表現(xiàn)為低滲透勢作用和離子毒害等。由于吸收了土壤環(huán)境中的大量鹽分,植物水分虧缺,生理代謝發(fā)生紊亂,在這期間植物細胞積累一系列的蛋白質(zhì)來保護細胞免受脫水傷害,其中LEA蛋白是最普遍的一種。雖然人們推測LEA蛋白可能在脫水脅迫中起重要作用,但對它們的生理生化功能及抗逆機理還不是十分清楚。本實驗室通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將TaLEA基因(DQ663481)轉(zhuǎn)化到小黑楊花粉植株中,獲得了11個轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊獨立轉(zhuǎn)化株系,研究過程中

2、發(fā)現(xiàn)了一株顯著不同于其他轉(zhuǎn)TaLEA小黑楊的矮化突變株(將此株系暫命名為dwfl),經(jīng)過耐鹽性分析發(fā)現(xiàn),dwfl的耐鹽能力與對照相比明顯增強,同時dwfl還表現(xiàn)出葉型改變、葉片較早老化等突變性狀。為深入研究dwfl的抗鹽機理及突變表型的分子機理,本研究分別在DNA、mRNA以及蛋白三個水平對dwfl進行了研究。
　　 利用TAIL-PCR的方法,在dwfl中克隆獲得了TaLEA基因的2個側(cè)翼序列。通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)這2個序列

3、分別位于一個反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子區(qū)和一個未知基因(與葡萄的假定蛋白XM_002267539.1同源)的啟動子區(qū)。利用RT-PCR的方法擴增該反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子中的反轉(zhuǎn)錄酶,結(jié)果在dwfl和野生型對照WT中均沒有擴增出目的條帶,推測該轉(zhuǎn)座子可能處于無活性狀態(tài)。利用熒光定量PCR的方法檢測該未知基因的表達情況,結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因在dwfl中上調(diào)表達,表達量是WT中表達量的2.22倍,推測TaLEA的插入可能影響了該基因的表達。目前,該基因功能未知。Dwfl突

4、變性狀是否是由于該基因的上調(diào)表達引起的,還有待進一步的功能驗證。
　　 在正常生長條件下,對dwfl小黑楊突變株與野生型對照進行了Affymetrix微陣列芯片的差異轉(zhuǎn)錄表達譜分析。利用SAM軟件對芯片數(shù)據(jù)進行了分析,以q-value(％)＜5,Fold Change＞2或＜0.5為標準篩選出差異基因537個,其中280個基因上調(diào)表達,257個基因下調(diào)表達。通過實時熒光定量PCR技術(shù)驗證,結(jié)果與芯片結(jié)果基本一致,證明芯片結(jié)果是可

5、靠的。這些差異基因中除43個功能未知或未分類的基因外,其他基因分為11類,包括代謝、脅迫、蛋白合成及降解、激酶、細胞壁、激素、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、運輸、細胞結(jié)構(gòu)基因及細胞命運等。通過分析發(fā)現(xiàn),與野生型對照相比,dwfl中很多脅迫誘導(dǎo)表達基因如Osmotin、RD22、chitinase、beta-1,3 glucanase、peroxidase、chalcone synthase、glutathioneS-transferase,WRK

6、Y,bZIP,AP2/EREBP,NAC,serinelthreonine kinase,stress-inducedreceptor-like kinase、lipid transfer protein等都上調(diào)表達。在正常生長條件,這些脅迫誘導(dǎo)表達基因的高量表達為dwfl的耐鹽性提供了分子依據(jù)。同時,在dwfl中很多與激素合成及調(diào)控相關(guān)的基因,如Cullin-1、DWF5、BAK1、AIL5、JAZ10等的表達水平也發(fā)生了顯著變化,推

7、測這些基因的變化很可能影響了激素的水平,進而影響了植物的生長發(fā)育,從而導(dǎo)致了dwfl植株矮化等的表型。
　　 利用無標記定量分析(Label-free LC MS/MS)的方法對dwfl小黑楊突變株與野生型對照進行了差異蛋白表達譜分析。結(jié)果顯示,以score值＞200,Flod Change＞1.3或＜0.75為標準,去除冗余后共篩選出99個差異表達的蛋白,dwfl與野生型對照相比,其中上調(diào)表達蛋白32個,下調(diào)表達蛋白17個,d

8、wfl中特異表達蛋白33個,野生型中特異表達蛋白17個。在99個差異蛋白中,除15個蛋白未能分類外,其它蛋白共分為8大類:代謝、脅迫、蛋白折疊、加工、降解、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細胞命運、運輸、細胞壁及細胞骨架。將無標記定量分析的結(jié)果與Affymetrix微陣列芯片結(jié)果進行比較發(fā)現(xiàn),在糖酵解、肌醇磷酸代謝、氮代謝等代謝通路中的差異基因,mRNA和蛋白質(zhì)豐度差異基本吻合。而信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、轉(zhuǎn)錄因子、激素及核糖體蛋白、轉(zhuǎn)錄起始因子等相關(guān)基因的mRNA與蛋白質(zhì)