玉米花期干旱脅迫下誘導(dǎo)基因的分離和功能分析.pdf

1、玉米是全球重要的糧、飼兼用作物，也是重要的能源作物，在糧食安全、能源安全等方面起著非常重要的作用。隨著全球性水資源的匱乏和玉米種植面積的不斷擴大，干早愈加成為玉米生產(chǎn)的發(fā)展的限制因素。我國有一半以上的玉米受到干旱的威脅，尤其是在玉米花期，干旱脅迫往往會造成敗育和嚴重減產(chǎn)。但是，由于對玉米抗旱機制，特別是對其開花期抗早的遺傳機制、對干旱脅迫的效應(yīng)研究較少，極大地限制著在育種手段與育種材料方面取得突破。本研究以抗旱性強的玉米自交系CN165

2、作為實驗材料，通過采用抑制差減雜交(SSH)方法構(gòu)建cDNA文庫，分離玉米雌穗和花絲干早脅迫下差異表達的基因，建立玉米花期干旱脅迫下雌穗和花絲誘導(dǎo)基因表達譜，解析玉米花期抗旱的分子機理，旨在為玉米抗旱育種及相關(guān)研究奠定新的理論內(nèi)容。 本研究構(gòu)建的cDNA文庫包含1920個陽性克隆，經(jīng)過PCR驗證后測序發(fā)現(xiàn)，1439條EST是有效序列，聚類分析得到361條uniESTs，BLASTX分析表明，有218條uniESTs和數(shù)據(jù)庫中的蛋

3、白序列有較高的相似性。99條uniESTs和數(shù)據(jù)庫中的核酸序列有較高的相似性，但是找不到匹配的蛋白序列，還有44條uniESTs在GenBank數(shù)據(jù)庫中既沒有相似的核酸序列也沒有相似的蛋白序列。218個已知功能的基因按照擬南芥功能基因組分類的方法可以分為13類，其中，與代謝相關(guān)的基因占27％，與蛋白質(zhì)合成相關(guān)的基因占16％，與蛋白質(zhì)加工相關(guān)的基因占10％，與轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因占10％，與細胞發(fā)育周期相關(guān)的基因占9％。 采用cDNA

4、Macroarray的方法對獲得的uniESTs進行分析，結(jié)果表明：160個uniESTs個在雌穗中是上調(diào)表達的，129個uniESTs在花絲中是上調(diào)表達的，125個uniESTs在雌穗和花絲都是上調(diào)表達的。為了驗證cDNA MacroarTay結(jié)果的可靠性，采用實時定量PCR(Real-time quantitativePCR)方法對cDNA文庫中的10個uniESTs進行了分析，結(jié)果表明兩種方法獲得的基因表達量是不完全一致的，但基因

5、的表達模式相同，說明利用cDNAMacroaiTay對cDNA文庫中分離到的基因進行表達譜的分析是可行的。 在這個cDNA文庫中發(fā)現(xiàn)了一個和來源于水稻與擬南芥ERD4基因相似性很高的uniEST，這個uniEST在干旱脅迫下的雌穗和花絲中都上調(diào)表達的。采用5’-RACE和3’-RACE的方法得到了這個uniEST的cDNA全長，命名為ZmERD4。ZmERD4包含2073個bp，其中1776bp的開放閱讀框，8bp的5'-UTR

6、和289 bp的3'-LITR。Southern blot結(jié)果表明ZmERD4在玉米基因組中含有一個拷貝。RNA gel blot結(jié)果表明ZmERD4受干旱脅迫、高鹽脅迫和ABA的誘導(dǎo)表達，但是不受低溫(4℃)脅迫誘導(dǎo)表達。亞細胞定位結(jié)果表明ZmERD4在細胞核中特異表達；ZmERD4編碼蛋白二級結(jié)構(gòu)分析顯示它是包含1個信號肽和7個跨膜區(qū)的整合膜蛋白；ZmERD4推導(dǎo)的氨基酸序列共具有8個蛋白激酶C磷酸化位點(Protein kinas

7、e C phosphorylation site)，14個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位點(Casein kinaseⅡphosphorylation site)和3個十四烷基化位點(N-myristoylation site)。由于蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ在細胞周期調(diào)節(jié)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面有重要的作用，因此推斷．ZmERD4可能在細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)方面受蛋白激酶C和酪蛋白激酶Ⅱ的調(diào)控；在逆境脅迫下，N-terminal myristoylation在膜靶和