玉米CMS-S核恢復(fù)基因和玉米對(duì)淹水脅迫響應(yīng)基因的功能分析.pdf

1、雜種優(yōu)勢(shì)的利用是提高作物單位面積產(chǎn)量的有效途徑。玉米(ZeamaysL.)是世界上最早利用雜種優(yōu)勢(shì)的作物之一。利用不育系進(jìn)行雜交制種可以免去人工去雄，降低了勞動(dòng)成本、提高種子純度，在雜種優(yōu)勢(shì)的利用中具有明顯的優(yōu)越性。為了更好地發(fā)揮玉米不育系在雜種優(yōu)勢(shì)利用中的作用，在理論上闡明細(xì)胞質(zhì)雄性不育(CMS)和育性恢復(fù)機(jī)理具有重要的理論意義，同時(shí)在核質(zhì)互作分子機(jī)理的研究領(lǐng)域中，CMS已成為重要的模式性狀。玉米CMS-S系的育性由線粒體上嵌合基因o

2、rf355/orf77和核基因(Rf3/rf3)共同決定。雖然orf355/orf77已被克隆，并對(duì)其影響細(xì)胞質(zhì)和核基因的表達(dá)進(jìn)行許多研究，但核育性基因Rf3/rf3的克隆，表達(dá)產(chǎn)物的鑒定、與線粒體基因和其他核基因互作關(guān)系的闡明等仍有待繼續(xù)深入的研究。本研究以Rf3/rf3近等基因系S-MO17Rf3Rf3/S-MO17rf3rf3為材料，利用cDNAmicroarray和抑制性扣除雜交(SSH)技術(shù)，在轉(zhuǎn)錄水平上對(duì)玉米CMS-S核恢復(fù)

3、基因進(jìn)行功能基因組學(xué)研究，得到以下初步結(jié)果： 1、在玉米S-Mo17Rf3Rf3生長(zhǎng)的不同時(shí)期，分別提取不同組織的mRNA，構(gòu)建了玉米幼芽(含胚芽鞘)、三葉期幼苗(含根系)、淹水處理后的三葉期幼苗(含根系)、六葉期整株(含根系)、拔節(jié)期莖間居間生長(zhǎng)組織、花藥、授粉5天后的雌穗和開(kāi)花期成熟葉共8個(gè)cDNA文庫(kù)；等量混合各文庫(kù)的質(zhì)粒DNA，采用基因組DNA飽和雜交法進(jìn)行均一化處理，構(gòu)建了一個(gè)含6×104個(gè)克隆的均一化cDNA文庫(kù)(M

4、ONL)。該文庫(kù)的插入片段在0.4kb～4.0kb之間，平均長(zhǎng)度為1.18kb;71％的序列為uniqueESTs，12％以上的插入片段為現(xiàn)有核酸數(shù)據(jù)庫(kù)中所沒(méi)有同源序列的新序列，76％的插入序列為未知功能序列。cDNA克隆代表了多個(gè)組織和發(fā)育時(shí)期的RNA，且代表高豐度表達(dá)基因的cDNA克隆所占比例低，平均每個(gè)持家基因在文庫(kù)中的頻率約為0.4％，能在均一化文庫(kù)中檢測(cè)到低豐度表達(dá)基因的cDNA克隆。 2、將MONL文庫(kù)中的cDNA插

5、入片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過(guò)Agarose膠電泳檢測(cè)，將擴(kuò)增質(zhì)量較好的10830個(gè)克隆的PCR產(chǎn)物，點(diǎn)制在尼龍膜上，制作cDNAmicroarray。使用5個(gè)組織的mRNA混合樣與cDNAmicroarray進(jìn)行重復(fù)雜交實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)芯片質(zhì)量，結(jié)果表明，重復(fù)實(shí)驗(yàn)的芯片間各對(duì)應(yīng)點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度和芯片內(nèi)兩重復(fù)點(diǎn)的信號(hào)強(qiáng)度的重復(fù)性較好，R2分別為0.9728和0.965。 3、采用不連續(xù)蔗糖密度梯度離心，將不同發(fā)育狀態(tài)的小孢子和花粉分為沒(méi)有形成

6、液泡的小孢子(Y)，已形成多個(gè)小液泡的小孢子(SV)、形成了大液泡的小孢子(LV)和淀粉充實(shí)或敗育程度不同的花粉(SF1～SF3/CP1～CP3)。分別將3種發(fā)育狀態(tài)(SV、LV、SF1/CP1)的S-(Rf3)和S-(rf3)花粉mRNA反轉(zhuǎn)錄后與cDNAmicroarray雜交，結(jié)果顯示，(1)SV、LV和SF與cDNAmicroarray雜交的陽(yáng)性克隆數(shù)分別為7611、7494和7105個(gè)。小液泡期的基因表達(dá)數(shù)目要比大液泡和花粉充

7、實(shí)期的基因表達(dá)數(shù)目要多(117個(gè)和506個(gè))，大液泡發(fā)育期的基因表達(dá)數(shù)目比花粉充實(shí)時(shí)期的多(392個(gè))，基因表達(dá)的數(shù)目從小液泡期到花粉充實(shí)期呈現(xiàn)逐步減少的趨勢(shì)，這一結(jié)果與不同發(fā)育時(shí)期小孢子和花粉內(nèi)實(shí)際的生理生化狀況相一致。(2)大液泡與花粉充實(shí)初期之間的基因表達(dá)差異最大，398個(gè)克隆存在4倍以上差異，占大約3.7％；大液泡期與小液泡期間，4倍以上差異表達(dá)的克隆有115個(gè)，占1.06％。(3)S-(Rf3)和S-(rf3)間，166個(gè)克隆

8、代表127個(gè)基因表現(xiàn)出4倍以上的差異。127個(gè)基因按功能可分為：花粉發(fā)育相關(guān)基因19個(gè)，占15％左右；信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因16個(gè)，占約13％；代謝相關(guān)基因19個(gè)，約占15％；與蛋白質(zhì)的合成和降解相關(guān)的基因16個(gè)，占13％；轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因6個(gè)，占5％；物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因5個(gè)，占4％；細(xì)胞防御和細(xì)胞凋亡相關(guān)基因9個(gè)，占7％；未知功能的序列27條，約占20％，其中新發(fā)現(xiàn)的序列10條，約占8％。 4、SSH分析發(fā)現(xiàn)了67個(gè)在S-(Rf3)和S-

9、(rf3)間差異表達(dá)的克隆，這些差異克隆代表13個(gè)基因，其中有3個(gè)基因(PG、expansin和allergen)與Microarray雜交結(jié)果相同。這些差異基因主要參與信號(hào)傳導(dǎo)、膜系統(tǒng)形成、花粉的成熟以及抗細(xì)胞衰老等生理活動(dòng)，但沒(méi)有發(fā)現(xiàn)參與糖代謝、淀粉合成及其轉(zhuǎn)運(yùn)相關(guān)基因。 5、4個(gè)抑制細(xì)胞凋亡基因(cystatin、Vdac2、BI-1和14-3-3)和2個(gè)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Translationallycontrolled

10、tumorprotein-likeprotein和leaf-senescence-relatedprotein)及Ca2+信號(hào)和G蛋白信號(hào)傳導(dǎo)相關(guān)基因在S-(Rf3)和S-(rf3)間的表達(dá)表現(xiàn)出顯著差異。Northernblot的結(jié)果與芯片雜交的結(jié)果基本一致，并且cystatin、Vdac2、BI-1和14-3-3等具有時(shí)空特異性表達(dá)特性?；ㄋ幒突ǚ鄣腄NA電泳證實(shí)，與S-(Rf3Rf3)比較，S-(rf3rf3)花藥組織中DNA提前

11、出現(xiàn)DNA片段化，并且，S-(rf3)花粉中也存在以寡聚核糖體為單位的DNA片段化。在CMS-S花粉中，線粒體上的呼吸鏈相關(guān)基因如CoxⅡ、Cytochromec1、ATPsynthaseβ-subunit和Inorganicpyrophosphatase以及與H+傳遞相關(guān)基因Thioredoxinm2和Dihydroflavanoidreductase等異常表達(dá)，導(dǎo)致呼吸鏈中斷和線粒體功能異常。 6、比較基因組方法將15個(gè)感興

12、趣的玉米ESTs和基因序列中的6個(gè)被定位在玉米第二染色體上，這6個(gè)基因分別為PP2C、CDPK、CDPK-relatedproteinkinase、Tim9、S-AdoMetDC和Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein；另外，CDPK、CDPK-relatedproteinkinase、Tim9和Translationallycontrolledtumorprotein-lik

13、eprotein的DNA序列被定位在2.09bin，并且Translationallycontrolledtumorprotein-likeprotein、Tim9和CDPK的DNA序列定位在與Rf3緊密連鎖標(biāo)記umc1525的兩側(cè)。 7、綜合以上分析結(jié)果，初步認(rèn)為S-(rf3)花粉中，orf355/orf77的表達(dá)，作為一種PCD信號(hào)，誘導(dǎo)與呼吸鏈相關(guān)基因的異常表達(dá)，S-(，rf3)花粉細(xì)胞的呼吸鏈無(wú)法實(shí)現(xiàn)正常功能，花粉細(xì)胞能

14、量虧缺，最終導(dǎo)致線粒體結(jié)構(gòu)和功能的異常，進(jìn)而激發(fā)由線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Rf3的作用機(jī)理可能是通過(guò)Ca2+信號(hào)途徑和小G蛋白介導(dǎo)的信號(hào)途徑，調(diào)節(jié)細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)基因(包括抑制細(xì)胞凋亡基因)轉(zhuǎn)錄本的積累，使得花粉正常發(fā)育途徑得以進(jìn)行，從而恢復(fù)花粉育性。 克隆玉米對(duì)低氧脅迫早期響應(yīng)基因并研究其功能是本研究所關(guān)注的另一領(lǐng)域。漬害是南方玉米生產(chǎn)的重要制約因子，淹水對(duì)玉米傷害的實(shí)質(zhì)是厭氧脅迫。玉米在厭氧脅迫過(guò)程中，早期響應(yīng)基因的表達(dá)對(duì)后期厭

15、氧多肽(ANPs)的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用，并直接影響著玉米對(duì)厭氧脅迫的代謝和形態(tài)適應(yīng)。因此，克隆玉米對(duì)低氧脅迫早期響應(yīng)基因并研究其功能，是當(dāng)前玉米抗逆性遺傳研究的重要課題。本研究對(duì)淹水脅迫2h后玉米根系中基因表達(dá)譜進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，151個(gè)克隆在對(duì)照與處理間存在2倍以上差異，其中，由于淹水處理而下調(diào)表達(dá)的克隆有37個(gè)，上調(diào)表達(dá)的有114個(gè)；32個(gè)克隆在對(duì)照與處理間存在3倍以上表達(dá)差異。這32個(gè)克隆代表24個(gè)非冗余基因，其主要功能涉

16、及到信號(hào)傳導(dǎo)、糖酵解、脂代謝、能量代謝、轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成等過(guò)程。另外，發(fā)現(xiàn)了3個(gè)新的受淹水誘導(dǎo)表達(dá)cDNA片段，并提交到了DNADataBase(CF569035～CF569037)。通過(guò)RACE擴(kuò)增，得到了1條玉米類(lèi)鋅指蛋白(ZmZF)的全長(zhǎng)cDNA(AY515607)。Northern分析也證明該基因在淹水處理的玉米根系被高效誘導(dǎo)表達(dá)。生物信息學(xué)分析說(shuō)明該基因所編碼的蛋白可能參與蛋白質(zhì)合成的起始。綜合分析在淹水脅迫后SKP1/ASK