白粉病菌誘導(dǎo)小偃麥異附加系SN6306差異表達基因的克隆與功能分析.pdf

1、小麥白粉病是由禾本科布氏白粉菌小麥專化型Blumeria graminis f.sp.tritici(Bgt)引起的氣傳性病害。在我國，自從上世紀(jì)90年代初兩次白粉病大流行后，小麥白粉病的發(fā)病面積都處在較高的水平上，已成為小麥高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要限制因素之一。由于在較短時間內(nèi)小麥白粉病菌就能突變成新的生理小種并且含單一抗性基因品種會在短期內(nèi)抗性減弱甚至喪失，因此發(fā)掘與利用新的抗病基因、培育具多抗病基因聚合的并持久抗病的品種具重要意義。本研究

2、以高感白粉病菌生理小種E09小麥品種YN15及其與中間偃麥草的雜交后代高抗白粉病菌生理小種E09小偃麥異附加系SN6306為研究對象，采用GeneFishing-PCR與RNA-seq技術(shù)對小麥白粉病菌E09誘導(dǎo)后的SN6306與YN15中的差異表達基因進行篩選。主要結(jié)果如下:
　　(1) GeneFishing-PCR技術(shù)篩選差異基因
　　利用GeneFishing-PCR對SN6306與YN15白粉菌誘導(dǎo)前后的cDNA序

3、列進行篩選，選取SN6306在白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達的差異條帶進行克隆測序，得到與基礎(chǔ)代謝(38.6％)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)(1.6％)、轉(zhuǎn)錄翻譯(11.8％)、蛋白合成(5.5％)、抗生物脅迫(11.8％)及抗非生物脅迫(11.0％)有關(guān)的127個EST序列。
　　(2)小麥TaARP1基因的克隆及功能初步分析
　　在GeneFishing-PCR獲得的SN6306在白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達結(jié)果中，經(jīng)過分析得到69B1為編碼TaARP1的

4、序列，經(jīng)PCR擴增得到長度分別為751 bp的cDNA與1072 bp的DNA序列，含有長度為181bp和140bp的兩個內(nèi)含子區(qū)，開放閱讀框為348bp，編碼115個氨基酸殘基。TaARP1與大麥、粗山羊草、短柄草等單子葉植物中的ARPs相似，進化上同源。qRT-PCR結(jié)果顯示，該基因在白粉菌誘導(dǎo)后比未誘導(dǎo)對照上調(diào)表達了約10倍。BSMV-VIGS結(jié)果顯示，該基因的短暫沉默，白粉病菌侵染后的小麥葉片的病斑比未沉默的對照葉片的病斑大，說

5、明其可能在響應(yīng)白粉病菌的過程中起作用。
　　(3)小麥TaTGA4基因的克隆及生物信息學(xué)分析
　　在GeneFishing-PCR獲得的SN6306在白粉菌誘導(dǎo)后上調(diào)表達結(jié)果中，經(jīng)過分析得到36113為編碼TaTGA4拘序列，經(jīng)PCR擴增得到長度為1444 bp的cDNA序列，預(yù)測編碼區(qū)長度為1221 bp，編碼含有406個氨基酸殘基的蛋白。該蛋白含有bZIP1superfamily與DOG1 superfamily保守結(jié)構(gòu)

6、域，與節(jié)節(jié)麥(Aegilops tauschii)TGA4的一致性(identities)達到92％，與烏拉爾圖小麥（Triticum urartu）TGA4的一致性(identities)達到90％。多序列聯(lián)配及系統(tǒng)發(fā)育分析得出小麥與節(jié)節(jié)麥和烏拉爾圖小麥的親緣關(guān)系較近，進化上有一定的同源關(guān)系。
　　(4) RNA-seq技術(shù)篩選差異基因
　　對白粉菌誘導(dǎo)后SN6306與YN15不同時間點各自的混合樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序。首先，

7、選取在YN15中讀數(shù)為0(Read B=0)的7個差異表達基因序列進行普通PCR擴增，擴增的測序結(jié)果與RNA-seq測序的結(jié)果一致，可以確信RNA-seq序列的準(zhǔn)確性，而且以基因組DNA為模板的擴增表明，有6條序列在SN6306及中間偃麥草中獲得了擴增產(chǎn)物且序列高度相似。其次選取YN15中讀數(shù)約為0(Read B≈0)的39個差異表達基因在白粉病菌誘導(dǎo)下的表達情況進行分析。這39個差異表達基因在YN15中的表達量基本沒有或者很少，而在S

8、N6306中表達，推測這些基因很有可能來源于其親本中間偃麥草。其中12個基因表現(xiàn)出白粉病誘導(dǎo)后上調(diào)表達的趨勢，上調(diào)表達量是對照的3倍至45倍不等。這些上調(diào)表達的基因編碼的產(chǎn)物中，主要是蛋白酶以及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白，包含內(nèi)部柯巴基二磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，ent-CPS）、豬籠草天冬氨酸蛋白酶（Aspartic proteinase nepenthesin）、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(serin