水稻中與水稻-稻瘟病菌互作相關(guān)的microRNA初步研究.pdf

1、稻瘟病是水稻最重要的病害之一，嚴重影響水稻的產(chǎn)量，因此研究水稻與稻瘟病菌相互作用具有重要意義。在植物中，miRNA可以調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育、生物和非生物脅迫等各個過程，但關(guān)于miRNA調(diào)節(jié)水稻與稻瘟病菌相互作用的研究還未見報道，因此本研究的主要目的是鑒定參與水稻-稻瘟病菌互作過程中水稻的miRNA。
　　在本研究中，我們對感病材料麗江新團黑谷(LTH)和抗病材料IRBLkm-Ts、IRBLz5-CA接種稻瘟病菌后，利用實時熒光定量PC

2、R實驗，DAB染色和臺盼藍染色等方法比較了防御反應的強弱;隨后，對刪和IRBLkm-Ts接種稻瘟病菌混合菌分生孢子，在接種前、接種后12小時和24小時分別取樣，提取小RNA，構(gòu)建了6個小RNA文庫并對這6個小RNA文庫進行高通量測序分析;用轉(zhuǎn)基因的方法獲得了過表達miR160a和miR398b的轉(zhuǎn)基因水稻植株，通過實時熒光定量PCR和接菌實驗，鑒定過表達miR160a和miR398b對稻瘟病抗性的影響。通過以上實驗，我們得到了如下結(jié)果:

3、
　　首先，我們發(fā)現(xiàn)IRBLkm-Ts比IRBLz5-CA具有更強烈的防御反應。主要表現(xiàn)為IRBLkm-Ts比IRBLz5-CA有更少的病斑;4個防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄在IRBLkm-Ts中明顯高于IRBLz5-CA;在IRBLkm-Ts中過氧化氫積累量高于IRBLz5-CA。這些結(jié)果說明利用IRBLkm-Ts可能更容易獲得與水稻抗稻瘟病相關(guān)的miRNA。
　　其次，我們篩選出33個在抗、感材料間和稻瘟病菌侵染前后積累量具有顯著

4、差異的miRNA。我們將這33個miRNA分為三類:(1)在LTH中沒有明顯變化或降低而在IRBLkm-Ts中明顯增加或沒有明顯變化;(2)在LTH中變化不明顯或增加而在IRBLkm-Ts中明顯降低或沒有明顯變化;(3)在LTH和IRBLkm-Ts中都增加。我們推測第1類miRNA正向調(diào)節(jié)水稻抗性，第2類miRNA負向調(diào)節(jié)水稻抗性，第3類miRNA則可能參與調(diào)節(jié)基礎(chǔ)抗性。
　　再次，過量表達miR160a和miR398b可提高稻瘟

5、病抗性。MiR160a在感病材料中接菌前和接菌后累積無明顯變化，而在抗病材料中接菌后增加了10倍以上，預示miR160a正向調(diào)節(jié)水稻抗性。MiR398b在感病和抗病材料中均在接種后累積顯著增加，預示miR398b可能參與對水稻稻瘟病基礎(chǔ)抗性的調(diào)控。同時，miR160a和miR398b的靶基因表達與相應miRNA累積量呈負相關(guān)性，表明miR160a和miR398b是通過調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄水平來參與調(diào)控稻瘟病抗性。過表達miR160a和miR

6、398b的轉(zhuǎn)基因水稻接種稻瘟病菌后，與對照相比病斑明顯變小，菌絲相對生長量降低，分生孢子數(shù)量明顯減少，說明miR160a和miR398b可以明顯增強水稻對稻瘟病的抗性。
　　最后，miR160a和miR398b以不同方式調(diào)控對稻瘟病菌的防御。我們發(fā)現(xiàn)miR160a過表達材料中早期防衛(wèi)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與對照相比無顯著差異，而晚期抗性標記基因轉(zhuǎn)錄則顯著增強;miR398b過表達材料中早期和后期抗性標記基因轉(zhuǎn)錄都顯著增強。這些結(jié)果提示mi