水稻OsMADS15基因功能研究及用酵母雙雜篩選互作蛋白.pdf

1、植物的生長(zhǎng)發(fā)育和形態(tài)建成是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，也是一系列基因在不同時(shí)間和不同空間上的順序表達(dá)的過(guò)程。其中轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)和活性對(duì)植物調(diào)節(jié)各類基因的時(shí)空表達(dá)和植物的生長(zhǎng)、發(fā)育具有重要的調(diào)控作用。植物MADS-box基因家族在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、代謝、應(yīng)對(duì)生物與非生物脅迫反應(yīng)等生理過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。
　　 水稻OsMADS15是一個(gè)AP1/SQUA亞家族的成員。本實(shí)驗(yàn)中，我們構(gòu)建了OsMADS15過(guò)表達(dá)載體，并用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法得到轉(zhuǎn)基

2、因系。用半定量PCR鑒定表明，在野生型水稻中OsMADS15主要表達(dá)在節(jié)、節(jié)間、成熟葉片、內(nèi)稃和外稃、漿片中，而在愈傷、根、雄蕊、心皮中表達(dá)低或沒(méi)有。而在OsMADS15轉(zhuǎn)基因植株中，這個(gè)基因在各個(gè)組織中均有較高的表達(dá)量。轉(zhuǎn)基因水稻出現(xiàn)早熟現(xiàn)象，并且可以觀察到轉(zhuǎn)基因水稻的矮化。在幼苗期它的節(jié)間就已經(jīng)伸長(zhǎng)。伸長(zhǎng)的節(jié)上長(zhǎng)出許多不定根，用Real Time-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)WOX11在轉(zhuǎn)基因水稻中表達(dá)量提高了近10倍。在伸長(zhǎng)的節(jié)上可以看到不定根

3、和腋芽的生長(zhǎng)。水稻過(guò)表達(dá)OsMADS15后分蘗推遲，并且在分蘗期時(shí)，分蘗數(shù)比野生型水稻的少。過(guò)表達(dá)OsMADS15后還使水稻長(zhǎng)出更多伸長(zhǎng)的節(jié)和節(jié)間。在短日照下，轉(zhuǎn)基因水稻的開花期比野生型早，但是株高卻普遍比野生型矮。用蛋白質(zhì)雙向電泳技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)OsMADS15過(guò)表達(dá)植株和野生型植株的葉片和花序的蛋白表達(dá)譜有一些差異。
　　 構(gòu)建了水稻全株的高質(zhì)量cDNA文庫(kù)。計(jì)算文庫(kù)的滴度約為1.8×106cfu/ml。用PCR鑒定插入片段表明

4、，插入片段一般都在750bp以上，空載率低，說(shuō)明構(gòu)建的cDNA文庫(kù)質(zhì)量較高。
　　 用酵母雙雜交法結(jié)合構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，篩選與OsMADS15有相互作用的蛋白。通過(guò)篩選得到86個(gè)陽(yáng)性克隆。經(jīng)測(cè)序并去除重復(fù)克隆后，共得到55個(gè)UniGene。用GO分析這些基因的功能和分類表明，在細(xì)胞成分方面，篩選到的基因主要是參與細(xì)胞、細(xì)胞的部分、大分子復(fù)合體和細(xì)胞器的組成。在分子功能方面，大部分的互作蛋白被歸類到結(jié)合和催化這兩種功能。在參與的

5、生物學(xué)過(guò)程方面，大部分的蛋白在代謝過(guò)程和細(xì)胞過(guò)程中產(chǎn)生作用。我們也篩到了幾個(gè)MADS-box基因家族的成員，如OsMADS1，OsMADS8和OsMADS14。OsMADS1和OsMADS8是E類基因，而OsMADS14是AP1/SQUA亞家族的成員。
　　 OsMADS1是已經(jīng)被證明和OsMADS15有相互作用的基因。這也證實(shí)了我們用酵母雙雜交方法篩選OsMADS15相互作用蛋白的實(shí)驗(yàn)是成功的。在煙草細(xì)胞中用BIFC實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證O