水稻CCT家族基因功能驗證，OsMADS3新等位基因突變機制的研究.pdf

1、1.植物開花是一個受外界環(huán)境和內(nèi)在基因共同調(diào)控的復(fù)雜過程，許多基因家族共同參與，形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。CCT基因家族基因參與調(diào)控植物開花。目前，水稻中41個CCT基因成員只有6個基因被證實調(diào)控開花。為更高效鑒定更多的CCT家族開花基因，本研究結(jié)合候選基因關(guān)聯(lián)分析與連鎖分析鑒定功能基因，通過轉(zhuǎn)基因進行功能驗證，并對其中一個CCT基因進行功能研究。研究結(jié)果如下:
　　1.1候選基因關(guān)聯(lián)分析與功能驗證
　　通過整合公共數(shù)據(jù)庫的水稻開花期Q

2、TL信息，共得到59個水稻開花期QTLs，與水稻41個CCT基因的物理位置比較，發(fā)現(xiàn)有25個CCT基因位于QTL區(qū)間內(nèi)。利用529份世界水稻種質(zhì)資源對CCT家族基因與水稻抽穗期性狀進行關(guān)聯(lián)分析，共有19個CCT基因與抽穗期相關(guān)。我們選擇了18個CCT基因進行轉(zhuǎn)化驗證，結(jié)果表明，8個關(guān)聯(lián)基因落在QTL區(qū)間，有5個基因通過轉(zhuǎn)基因驗證確定調(diào)控開花;4個關(guān)聯(lián)基因不在QTL區(qū)間，但有2個通過轉(zhuǎn)基因驗證與開花相關(guān);6個既沒關(guān)聯(lián)到也不在QTL區(qū)間的基

3、因都不參與水稻開花調(diào)控。
　　1.2 CCT家族基因表達模式與核酸多樣性
　　根據(jù)基因所含功能結(jié)構(gòu)域?qū)CT基因分為CMF亞家族，COL亞家族和PRR亞家族。在日本晴5個不同發(fā)育時期的葉片和莖稈中對CCT的35個基因進行了表達模式分析，發(fā)現(xiàn)三個亞家族的基因大部分都在葉片中表達豐富，部分基因在莖稈中也有較高的表達。41個CCT基因在529份栽培稻和107份野生稻中中共有4002個SNPs，CCT家族基因的平均核酸多樣性兀=2.

4、7×10-3，多數(shù)CCT基因的核酸多樣性在每1kb有1到8個SNPs。
　　1.3 OsCCT01基因功能研究
　　OsCCT01屬于CMF亞家族，超量表達OsCCT01導(dǎo)致中花11在長日照下抽穗期延遲25天，短日照下延遲15天。抑制表達OsCC T01則沒有出現(xiàn)抽穗期相關(guān)表型。通過檢測光周期途徑相關(guān)基因在超表達植株中的表達，發(fā)現(xiàn)OsCCT01是通過抑制Ehd1基因及其下游Hd3a和RFT1基因的表達而抑制開花。除了抽穗期的

5、表型，OsCCT01同時出現(xiàn)株高變矮，分蘗減少，產(chǎn)量下降等發(fā)育相關(guān)表型，通過激素處理發(fā)現(xiàn)OsCCT01對BR響應(yīng)顯著，檢測BR受體基因OsBRI1和BR信號傳導(dǎo)途徑上的相關(guān)基因在超量植株中的表達水平的變化，推測OsCCT01參與BR信號傳導(dǎo)途徑;檢測了細胞周期基因在超表達植株中的表達量差異，結(jié)果表明3個G2/M期的基因在OsCCT01超表達陽性植株中明顯下降。推測，OsCCT01可能處在細胞周期核心調(diào)控元件的下游調(diào)節(jié)細胞分裂。OsCCT

6、01對植株發(fā)育的機制有待深入研究。
　　2.作物遺傳改良的基礎(chǔ)是自然變異，自然變異是由自發(fā)突變形成。在構(gòu)建重組自交系過程中，RI127發(fā)生自然突變成隱性雄性核不育系RI127S。通過圖位克隆的方法鑒定出OsMADS3就是控制雄性不育的基因，該基因已有文獻報道其調(diào)控花器官發(fā)育和雄性不育。利用交錯式熱不對稱PCR分離到1633 bp序列插到OsMADS3基因內(nèi)部，導(dǎo)致它不能正常轉(zhuǎn)錄而喪失功能。1633 bp序列來自第5染色體上一個反轉(zhuǎn)

7、座子的片段。分析OsMADS3在530份自然群體和107份普通野生稻中的核酸多態(tài)性，共有7種單倍型，98％的品種是都是H2類型，表明OsMADS3是功能特別重要的持家基因，在自然進化過程中必須高度保守，這與它決定雄性育性是吻合的。RI127S來自秈稻特青和廣親和品種02428雜交后代，攜帶02428的S5基因型。RI127具有優(yōu)良的農(nóng)藝性狀和廣親和性，因此RI127S是輪回育種中一個好的中間體，省去輪回選擇中品種間雜交的繁重人工去雄工作