靶向調(diào)控EMS1基因miRNAs分子的鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、目的：EMS1基因是一種癌基因，首先從乳腺癌和頭頸部鱗癌中被克隆出來(lái)而被人們所認(rèn)知。本課題組前期發(fā)現(xiàn)EMS1基因?yàn)槲赴┫嚓P(guān)基因，在胃癌中高表達(dá)，與轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。有研究表明，EMS1基因在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中受多個(gè)miRNA的調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)生物信息學(xué)技術(shù)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)從轉(zhuǎn)錄后水平篩選鑒定出靶向調(diào)控人EMS1基因的miRNAs分子，闡明EMS1基因在胃癌中表達(dá)上調(diào)的分子機(jī)制，為胃癌的臨床診斷、靶向治療及判斷預(yù)后提供理論依據(jù)。
　　

2、方法：
　?。?）利用生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)EMS1基因的靶miRNA分子，并通過(guò)pubmed、中國(guó)知網(wǎng)等網(wǎng)站進(jìn)行文獻(xiàn)檢索，篩選出未報(bào)道過(guò)，可能性較高的miRNAs。
　?。?）選擇陽(yáng)離子脂質(zhì)體法,將初篩出的靶miRNA mimic/inhibi-tor瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至胃癌細(xì)胞MGC803中,再采用Western blot技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)染48h后空白組、miRNA mimic/inhibitor NC對(duì)照組及miRNA mimic/inh

3、ibitor實(shí)驗(yàn)組EMS1蛋白的表達(dá)變化。
　　（3）利用MTT實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)和體外遷移侵襲實(shí)驗(yàn),檢測(cè)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-545-3p mimic/inhibitor對(duì)MGC803細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)行為的影響。
　　結(jié)果：生物信息學(xué)結(jié)果顯示：miR-182、miR-501-3p、miR-338-5p、miR-183、miR-502-3p、miR-545、miR-329、miR-603、miR-326、miR-526a、

4、miR-548d-3p等11個(gè)miRNA可能是EMS1基因的靶miRNA。文獻(xiàn)檢索結(jié)果顯示：在腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)的有miR-182、miR-501-3p、miR-338-5p、miR-183、miR-502-3p等5個(gè)miRNA；表達(dá)下調(diào)的有miR-182、miR-545、miR-603、miR-329、miR-326等5個(gè)miRNA；未見(jiàn)報(bào)道的有miR-526a和miR-548d-3p。在5個(gè)下調(diào)的miRNA中miR-326、miR-

5、182是EMS1基因的靶miRNA已有報(bào)道，其余3個(gè)miRNA與EMS1基因的相關(guān)性尚未見(jiàn)研究。因此本課題組選出miR-545、miR-329、miR-603可能是EMS1基因的靶miRNA分子。
　　miRNAs與EMS13’UTR靶結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測(cè)結(jié)果顯示：miR-545-3p與EMS1的結(jié)合位點(diǎn)為162-168;miR-329-3p與EMS1的結(jié)合位點(diǎn)為863-869和1184-1190；miR-603與EMS1的結(jié)合位點(diǎn)為1

6、042-1048.
　　Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：miR-545-3p、miR-329-3p、miR-603三種miRNA mimic瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后，與空白組和NC組相比miR-545-3p組EMS1蛋白的表達(dá)下降，p<0.05，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；miR-329-3p、miR-603組與空白組和NC組相比則EMS1蛋白表達(dá)無(wú)明顯差異（p>0.05）。將miR-545-3p、miR-329-3p、miR-6

7、03三種miRNA inhbitor分別瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MGC803細(xì)胞后，與空白組和NC組相比miR-545-3p組EMS1蛋白的表達(dá)升高（p<0.05）；miR-329-3p、miR-603組與空白組和NC組相比則EMS1蛋白表達(dá)變化無(wú)明顯差異（p>0.05）。
　　MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白組和NC組相比，胃癌MGC803細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-545-3p mimic后,細(xì)胞增殖能力減弱(p<0.05)；相反地， 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染m

8、iR-545-3p inhibitor后細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)（p<0.05）。實(shí)驗(yàn)表明miR-545-3p高表達(dá)可以抑制胃癌細(xì)胞MGC803的增殖能力；其被抑制后可使MGC803細(xì)胞的增殖能力增強(qiáng)。
　　遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示MGC803細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-545-3p mimic后，與空白組和mimic NC組相比細(xì)胞遷移和能力均減弱（p<0.05）；MGC803細(xì)胞瞬時(shí)轉(zhuǎn)染miR-545-3p inhi