豬APC1和APC2基因的分離、鑒定及其功能的初步研究.pdf

1、腺瘤樣結(jié)腸息肉蛋白(adenomatous polyposis coli protein,APC)是家族性結(jié)腸息肉瘤(family adenomatous polyposis,FAP)以及散發(fā)性結(jié)腸癌的抑癌基因,該基因的突變與癌癥的發(fā)生有密切關(guān)系。APC基因編碼的APC蛋白是一個(gè)多功能腫瘤抑制蛋白家族,可與細(xì)胞內(nèi)蛋白如Axin-2、JUP、EB1和微管蛋白等相互作用,調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)功能。APC通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路中β-catenin的水平

2、,抑制Wnt信號(hào)通路,從而控制腸、皮膚、免疫系統(tǒng)、骨和腦中的細(xì)胞增殖和分化。
　　 用富含亞麻籽來(lái)源的不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids,PLIFA)日糧飼喂生長(zhǎng)育肥豬,可以提高育肥豬肌肉重和肌內(nèi)脂肪含量,利用基因芯片技術(shù)分析發(fā)現(xiàn)Wnt信號(hào)通路中的基因均有明顯的表達(dá)差異,其中APC基因的差異性最大,因此選取APC基原因研究對(duì)象。在本研究中,分離和克隆了豬APC基因家族的APC1和APC2兩個(gè)基因

3、,并比較分析了APC1和APC2的基因結(jié)構(gòu)、功能特征、蛋白進(jìn)化關(guān)系和組織表達(dá)模式。研究PUFA對(duì)APC基因家族表達(dá)的影響以及APC基因家族在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程的作用。本研究所得的主要結(jié)果如下:
　　 1.利用電子克隆的方法獲得豬APC1和APC2基因的cDNA序列。獲得豬APC1基因cDNA序列8829 bp,包含一個(gè)最長(zhǎng)為8367 bp的開放閱讀框,編碼2788個(gè)氨基酸,APC1蛋白含有ARM(armadillo)重復(fù)序列、AP

4、C堿性結(jié)構(gòu)域、EB1結(jié)合區(qū)域等保守結(jié)構(gòu)；豬APC2基因cDNA序列全長(zhǎng)為7067 bp,包含一個(gè)最長(zhǎng)為6798 bp的開放閱讀框,編碼2265個(gè)氨基酸,APC2蛋白含有ARM重復(fù)序列,APC腫瘤抑制蛋白區(qū)域,APC堿性結(jié)構(gòu)域等保守結(jié)構(gòu)域。
　　 2.根據(jù)所公布的豬基因組物理圖譜數(shù)據(jù)庫(kù),將豬APC1和APC2基因分別定位在豬2q24和2q11。根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中公布的各物種APC家族蛋白序列,利用MEGA4.1軟件分析AP

5、C家族蛋白的進(jìn)化關(guān)系,發(fā)現(xiàn)APC蛋白家族在物種間具有高度的保守性。
　　 3.利用生物信息學(xué)軟件分析豬APC1和APC2基因啟動(dòng)子區(qū)域,發(fā)現(xiàn)豬APC1基因啟動(dòng)子區(qū)沒(méi)有CpG島的存在,豬APC2基因啟動(dòng)子區(qū)的235～448和589～821區(qū)域存在CpG島,豬APC1和APC2基因的啟動(dòng)子區(qū)存在大量的脂肪形成相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。
　　 4.利用半定量RT-PCR的方法檢測(cè)了豬APC1和APC2基因在豬體各組織中的表達(dá)情況

6、,發(fā)現(xiàn)豬APC1和APC2基因在豬10個(gè)組織均有表達(dá),表達(dá)具有廣泛性。
　　 5.利用酶消化法成功分離豬ADSCs,并利用免疫組織化學(xué)和分子生物學(xué)方法檢測(cè)細(xì)胞標(biāo)記蛋白CD44的表達(dá)情況,CD44呈陽(yáng)性表達(dá),說(shuō)明分離到的細(xì)胞是豬ADSCs。
　　 6.通過(guò)用不同濃度的ω-3 PUFA和ω-6 PUFA處理豬ADSCs,檢測(cè)PUFA對(duì)APC基因家族的影響,發(fā)現(xiàn)隨著PUFA濃度的增加,APC基因的mRNA的表達(dá)水平逐漸上調(diào),兩

7、者之間存在劑量依賴關(guān)系。
　　 7.利用成脂誘導(dǎo)劑對(duì)豬ADSCs進(jìn)行誘導(dǎo)分化,利用定量PCR和Western blot檢測(cè)APC1和APC2基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá)情況,發(fā)現(xiàn)APC1和APC2基因在脂肪細(xì)胞分化早期高表達(dá),同時(shí)檢測(cè)Wnt信號(hào)通路相關(guān)基因β-catenin、GSK3β和Axin基因在脂肪細(xì)胞分化過(guò)程中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)在分化過(guò)程中β-catenin的mRNA和蛋白水平都顯著降低,GSK3β的表達(dá)趨勢(shì)和APC的表達(dá)趨