豬生產(chǎn)性狀QTL區(qū)域5個候選基因的分離、鑒定及功能初步研究.pdf

1、本研究根據(jù)國內(nèi)外報道的QTL定位結(jié)果、豬基因的定位信息、豬-人比較圖譜以及基因生理、生化功能四方面信息,從豬4、12和17號染色體上生產(chǎn)性狀QTL區(qū)域內(nèi)選取5個基因作為擬分離的候選基因,目前,這些基因的序列、結(jié)構(gòu)和功能在豬中尚未見報道。應(yīng)用比較基因組學(xué)、生物信息學(xué)等方法分離鑒定了這些基因以及基因的不同轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,研究了5個基因的某些多態(tài)性位點與豬重要生產(chǎn)性狀的相關(guān)性以及基因的時空表達情況,并對基因的啟動子進行了基礎(chǔ)研究。本研究具體結(jié)果如下

2、:
　　 1.CA3(碳酸酐酶3)基因:
　　 (1)本研究以人CA3基因序列作為探針,在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中比對得到豬EST序列并進行拼接。根據(jù)拼接序列設(shè)計引物在豬cDNA中擴增,獲得了大白、長白、梅山三個豬種CA3基因全長編碼序列891bp,梅山品種序列己提交到GenBank,登錄號為AY789514。序列分析發(fā)現(xiàn),該cDNA序列具有783bp的開放閱讀框,編碼260個氨基酸組成的蛋白質(zhì),其編碼區(qū)序列與人、鼠的相

3、似性均為87％。(2)根據(jù)已獲得的cDNA序列設(shè)計引物,在豬基因組DNA中擴增,獲得三個豬種CA3基因基因組全長序列9589bp,該基因包含7個外顯子和6個內(nèi)含子,梅山品種序列提交到GenBank,登錄號為DQ675018。(3)建立了該基因第1內(nèi)含子363bp處C/T突變的PCR-NcoⅠ-RFLP分型方法；在所檢測的8個豬種中,國外豬種中均是B等位基因占優(yōu)勢,而在梅山豬中只檢測到了AA基因型；在其它的地方豬種中,兩種等位基因均存在；

4、在139頭大×梅F2代資源群體中進行NcoⅠ-RFLP標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析,該位點基因型不同時,皮率、肥肉率、瘦肉率、瘦肥比率、板油重、花油重、眼肌高、眼肌面積、背膘厚、股二頭肌色值和肌內(nèi)水分差異顯著或極顯著。(4)不同豬種間多序列比對發(fā)現(xiàn),在該基因內(nèi)含子5中存在SJ160微衛(wèi)星位點,內(nèi)含子4中存在SJ158微衛(wèi)星位點和一個串聯(lián)重復(fù)為TC的新微衛(wèi)星位點；在所檢測的7個豬種中,SJ160微衛(wèi)星位點發(fā)現(xiàn)了2個等位基因,SJ158微衛(wèi)星位點和

5、串聯(lián)重復(fù)為TC的新微衛(wèi)星位點均發(fā)現(xiàn)了3個等位基因。(5)在320頭大×梅F2代資源群體中進行微衛(wèi)星標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析,SJ160微衛(wèi)星位點基因型不同時,胴體長、肩部背膘厚和臀部背膘厚性狀差異顯著或極顯著；SJ158微衛(wèi)星位點不同基因型在皮率、骨率、肥肉率、瘦肉率、屠宰率、板油重、內(nèi)脂率、肋骨數(shù)、6-7腰椎間背膘厚、臀部背膘厚和肌內(nèi)脂肪性狀存在顯著差異；串聯(lián)重復(fù)為TC的新微衛(wèi)星位點與皮率、屠宰率、內(nèi)脂率、胴體長、臀部背膘厚、平均背膘厚和

6、平均皮厚關(guān)聯(lián)顯著。(6)利用熒光定量PCR技術(shù)對CA3基因進行定量分析顯示,該基因在大白豬和梅山豬肌肉組織中差異表達,在梅山豬中高表達；該基因在大白豬肌肉發(fā)育的三個階段(1日齡、60日齡、120日齡)均有表達,而且表達量隨日齡呈遞增的趨勢。
　　 2.PKLR(肝臟丙酮酸激酶)基因:
　　 (1)利用人、鼠PKLR基因的保守序列設(shè)計引物,在豬基因組DNA中擴增,獲得了大白、長白、梅山三個豬種PKLR基因部分基因組序列23

7、67bp,包含該基因第3外顯子到第9內(nèi)含子序列。(2)建立了該基因第4外顯子上G/A替換的PCR-HaeⅢ-RFLP和第9外顯子上C/T替換的PCR-CfoⅠ-RFLP分型方法。在所檢測的5個豬種中,除了鄂西黑豬外,其它豬種HaeⅢ-RFLP均檢測到三種基因型；在322頭大×梅F2代資源家系中進行關(guān)聯(lián)分析,該位點基因型不同時,板油重、6-7腰椎間背膘厚、平均皮厚和眼肌高性狀差異顯著。在所檢測的5個豬群中,CfoⅠ-RFLP存在三種基因型

8、,梅山豬中僅檢測到BB基因型,其它豬群三種基因型均存在；在124頭試驗豬群(長白豬、大白豬、大白×長白雜種豬、長白×大白雜種豬)中進行性狀關(guān)聯(lián)分析,該位點僅對骨率、臀部背膘厚、肌內(nèi)脂肪和肌內(nèi)水分具有顯著效應(yīng)。
　　 3.AGL(糖原脫支酶)基因:
　　 (1)利用SMART技術(shù)、染色體步移及RT-PCR方法,鑒定了大白、梅山、杜洛克三個豬種AGL基因4種不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物,其cDNA全長序列分別為5506bp、5550bp、

9、5232bp和5402bp；它們均具有4599bp的相同開放閱讀框和537bp的3’非翻譯區(qū)序列,通過在5’非翻譯區(qū)(外顯子1和外顯子2)的選擇性剪接形成4種不同形式的mRNA。(2)建立了5’非翻譯區(qū)C/T轉(zhuǎn)換的PCR-HpyCH4V-RFLP分型方法。(3)通過染色體步移獲得翻譯起始位點上游1489bp的5’末端序列,序列分析發(fā)現(xiàn)該序列具備高等動物啟動子的一般特征:TATA框、CAAT框、GC框。另外,該序列中還存在一個.525bp

10、的CpG島區(qū)域和一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點。
　　 4.ENO3(肌肉特異性烯醇化酶)基因:
　　 (1)根據(jù)人、鼠保守序列進行RT-PCR擴增并結(jié)合SMART技術(shù)獲得了大白、長白、梅山三個豬種ENO3基因的cDNA全長序列1437bp,大白品種序列己提交到GenBank,登錄號為DQ355513。序列分析顯示,該cDNA序列具有1305bp的開放閱讀框,從第二外顯子翻譯,編碼434個氨基酸組成的蛋白質(zhì),其編碼區(qū)序列與人

11、、鼠的相似性分別為90％和85％。(2)通過RACE-PCR以及直接在外顯子1末端設(shè)計引物鑒定了該基因兩種不同的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物:由選擇性剪接,在外顯子1的3’末端插入/缺失142bp的片段而形成兩種不同形式的mRNA,其中具有完整外顯子1序列的代表轉(zhuǎn)錄本1,而缺失142bp片段的短形式的mRNA代表轉(zhuǎn)錄本2。以最小自由能規(guī)則為依據(jù)的算法預(yù)測該基因5’非翻譯區(qū)(UTR)RNA的二級結(jié)構(gòu)顯示,該基因兩個轉(zhuǎn)錄本存在不同的二級結(jié)構(gòu),轉(zhuǎn)錄本1的5’UT

12、R二級結(jié)構(gòu)相對比較穩(wěn)定,這可能是導(dǎo)致該轉(zhuǎn)錄本表達水平相對較低的因為。(3)根據(jù)已獲得的cDNA序列設(shè)計引物,在豬基因組DNA中擴增,獲得三個豬種ENO3基因基因組全長序列5376bp,包含12個外顯子和11個內(nèi)含子,大白品種序列己提交到GenBank,登錄號為DQ676935。(4)建立了該基因第9內(nèi)含子內(nèi)405bp處T缺失突變的PCR-StuⅠ-RFLP分型方法；在所檢測的8個豬種中,均存在兩個等位基因,國內(nèi)豬種大部分均是A等位基因占

13、優(yōu)勢,而長白、杜洛克豬中是B等位基因占優(yōu)勢。分別在132頭試驗豬群(長白豬、大白豬、大白×長白雜種豬、長白×大白雜種豬)和138頭大白×梅山F2代資源群體中進行StuⅠ-RFLP標(biāo)記與性狀的關(guān)聯(lián)分析,該位點基因型不同時,肥肉率、背膘厚、肌肉色值、大理石紋和肌內(nèi)脂肪性狀差異顯著。(5)利用實時熒光定量PCR技術(shù)對ENO3基因的兩個轉(zhuǎn)錄本進行時空表達分析顯示:除了脾以外,該基因轉(zhuǎn)錄本1在其它的9個組織(肌肉、脂肪、心、肝、肺、腎、胃、小腸、

14、子宮)中均有表達,在肝臟和肺中表達豐度最高,在肌肉和子宮中相對表達量最低；而轉(zhuǎn)錄本2在以上所有的組織中均有表達,在肌肉和心臟中表達量最高,在脂肪、肺和胃中表達量次之,在肝臟、脾、腎、小腸和子宮中均是少量表達。不同品種間表達分析顯示,兩個轉(zhuǎn)錄本在60日齡大白豬和梅山豬肌肉組織中均差異表達,轉(zhuǎn)錄本1在梅山豬中高表達,相反,轉(zhuǎn)錄本2在大白豬中高量表達,而在梅山豬中低表達。在大白豬三個不同發(fā)育階段肌肉組織中,兩個不同轉(zhuǎn)錄本均有表達,轉(zhuǎn)錄本1的表

15、達量隨日齡的增加有所降低；而轉(zhuǎn)錄本2在1日齡時表達量最高,2月齡略有下降,在4月齡時表達量又升高。在以上所有肌肉組織和其它組織樣品中,除了肝臟和腎以外,轉(zhuǎn)錄本1的表達量均顯著低于轉(zhuǎn)錄本2的表達量,尤其是在肌肉組織中,兩個轉(zhuǎn)錄本的表達豐度相差最大。(6)通過基因組步移獲得該基因轉(zhuǎn)錄起始位點上游1090bp的啟動子序列,序列特征分析顯示:該序列中存在TATA框、GCboxes、一個長度為388 bp的CpG島區(qū)域和一些潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點

16、(MEF3、MEF2、AP-1、Sp-1、GATA-1、EGR1、USF、N-Myc、STAT、MyoD、AREB6、MAZ、MZF1)。(7)在該基因的啟動子區(qū)構(gòu)建6個缺失片段報告基因表達載體,瞬時轉(zhuǎn)染豬腎細胞系,分析啟動子活性,發(fā)現(xiàn)從-139bp到+108bp沒有啟動子活性,而其它5種缺失體都存在啟動子活性；從-964bp到-794bp和-536bp到-355bp內(nèi),相對熒光素酶活性降低；而從-794bp到-536bp和-355bp

17、到-260bp內(nèi),相對熒光素酶活性上升。
　　 5.FOXA2/HNF3B(肝細胞核因子3B)基因:
　　 (1)以人FOXA2基因序列作為探針,在NCBI的EST數(shù)據(jù)庫中比對得到豬EST序列并進行拼接。根據(jù)拼接序列設(shè)計引物,在豬cDNA中擴增,獲得大白、梅山兩個豬種FOXA2基因的完全編碼序列1891bp,該序列具有1374 bp的開放閱讀框,編碼457個氨基酸組成的蛋白質(zhì)。(2)根據(jù)已獲得的cDNA序列設(shè)計引物,在豬