甜橙CsMYBF1基因的功能鑒定和調(diào)控機理研究.pdf

1、柑橘是世界上最重要的果樹之一，富含種類豐富的苯丙烷類化合物。苯丙烷類化合物作為植物中重要的次生代謝類物質，在柑橘果實品質的形成及對逆境的抵御等方面都起到了重要作用。苯丙烷類化合物的代謝調(diào)控機制研究是有效利用此類化合物的基礎，而目前柑橘中苯丙烷類化合物代謝調(diào)控的研究仍非常之少，這也一定程度上限制了柑橘中相關遺傳改良工作的開展。MYB轉錄因子是植物中最大的轉錄因子家族之一，參與了植物中眾多生物學過程的調(diào)控，MYB轉錄因子調(diào)控植物苯丙烷代謝的

2、相關功能在多種植物中已有廣泛的報道。本研究以柑橘中的MYB轉錄因子為切入點，通過生物信息學方法，在全基因組范圍內(nèi)鑒定了MYB家族各成員的相關信息。并從中挑選出CsMYBF1作為候選基因，對其潛在的調(diào)控苯丙烷代謝的相關功能及機制展開了深入研究。主要研究結果如下:
　　1.甜橙基因組范圍內(nèi)R2R3類型的MYB家族成員分析。從甜橙基因組中共鑒定出100個R2R3類型的MYB轉錄因子，其中有87個基因不均勻地分布在9條染色體上，以2號染色

3、體上分布為最多。甜橙中存在21個片段復制和8個串聯(lián)復制的MYB基因。構建了甜橙與擬南芥中MYB家族成員的進化樹，將甜橙中的100個MYB轉錄因子分為29個亞族，MYB基因的基因結構及保守基序分析進一步證實了分類結果的可靠性。轉錄組數(shù)據(jù)和定量PCR實驗提供了各MYB成員的基因表達信息，結合基因間的進化關系特點，本研究預測了各MYB基因的功能，為后期開展柑橘中MYB基因的功能研究提供了參考。
　　2.CsMYBF1基因的功能鑒定及調(diào)控

4、機理研究。從組學分析結果中挑取了可能與黃酮醇類化合物調(diào)控相關的CsMYBF1做進一步的功能分析。利用RACE技術克隆得到了CsMYBF1基因全長，進化分析表明CsMYBF1與已報道的黃酮醇調(diào)控相關的MYB基因有較近的親緣關系?；虮磉_分析表明，CsMYBF1基因在果皮組織、幼果果肉及新葉中有較高的表達。亞細胞定位分析顯示CsMYBF1定位在細胞核中。拷貝數(shù)分析顯示CsMYBF1基因在多個柑橘類型中均為單拷貝。轉錄激活分析表明CsMYBF

5、1可能需要與其他蛋白形成復合體來行使其轉錄激活的功能。
　　將CsMYBF1基因超量表達轉入番茄，成功得到了轉基因番茄植株。次生代謝產(chǎn)物分析表明，轉基因番茄果實中羥基肉桂酸類化合物含量明顯增加，黃酮醇類物質含量沒有顯著差異。數(shù)字表達譜分析鑒定出了一系列差異表達基因，包括糖酵解途徑、莽草酸途徑及苯丙烷途徑中的多個差異基因。在柑橘愈傷中干涉CsMYBF1基因的表達，顯著降低了愈傷組織中羥基肉桂酸類、黃酮醇類及黃酮類化合物的含量。定量P

6、CR結果表明一系列柑橘中苯丙烷途徑結構基因的表達也明顯降低。在山金柑中干涉CsMYBF1基因的表達也得到了相似的結果。
　　啟動子激活實驗表明，CsMYBF1可以激活番茄和柑橘中苯丙烷途徑上的多個結構基因的啟動子。進一步分析表明，CsMYBF1可以激活柑橘中但不能激活番茄中的CHS基因啟動子;CsMYBF1可以通過作用于MYPLANT順式元件直接激活相應的苯丙烷途徑結構基因啟動子。酵母單雜交與EMSA實驗進一步證實CsMYBF1可