低溫脅迫下茶樹CsCBF1調(diào)控途徑及其功能鑒定的初步研究.pdf

1、CBF(C-repeat binding transcription factor/dehydrate responsive element bindingfaclor，DREB)轉(zhuǎn)錄激活因子是受低溫特異誘導(dǎo)的一類反式作用因子，調(diào)控多個抗寒基因的啟動子區(qū)上的順式作用元件(CRT/DRE)，從而促進(jìn)啟動子中含有該調(diào)控元件的多個脫水誘導(dǎo)和冷誘導(dǎo)基因的表達(dá)，激活植物體內(nèi)多種抗逆機(jī)制。CBF是脅迫應(yīng)答過程中產(chǎn)生的調(diào)節(jié)性蛋白，脫水素則是與冷誘導(dǎo)相

2、關(guān)的下游功能性蛋白。ICE1是CBF轉(zhuǎn)錄子的上游激活因子，低溫應(yīng)答過程中通過ICE1-CBF冷調(diào)控途徑作用下游大量靶基因提高植物抗寒性。 本研究采用0℃低溫處理不同時間段的茶樹cDNA為模板，根據(jù)GenBank上已登錄的茶樹CsCBF1序列(EU563238)，CsICE1序列，以及脫水素Y2SK2，脫水素SK2序列，進(jìn)行半定量RT-PCR，分析每種基因在冷誘導(dǎo)條件下的表達(dá)情況，初步推測茶樹的脫水素基因的啟動子中可能含有CRT/DRE

3、順式作用元件，其表達(dá)有可能受到CsCBFl的調(diào)控。
　　為了進(jìn)一步驗證茶樹CsCBF1基因抗寒功能，設(shè)計特異性引物擴(kuò)增出CsCBF1基因，利用載體pBI121為骨架結(jié)構(gòu)，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121-CsCBF1，根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤法將構(gòu)建的表達(dá)載體導(dǎo)入煙草中，獲得大量抗性植物。 對抗性煙草進(jìn)行PCR分析，鑒定外源CsCBF1基因是否導(dǎo)入并整合到煙草基因組上轉(zhuǎn)錄表達(dá)，92％的抗性植物均擴(kuò)增出目的條帶。對PCR呈陽性的轉(zhuǎn)基因煙草

4、提取RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄RT-PCR檢測，83％擴(kuò)增出CsCBF1基因特異條帶，說明CsCBF1在轉(zhuǎn)基因煙草內(nèi)得到了正常轉(zhuǎn)錄表達(dá)。取RT-PCR鑒定為陽性的轉(zhuǎn)基因煙草組織進(jìn)行GUS活性染色，轉(zhuǎn)CsCBF1基因煙草植株的根莖葉中均呈現(xiàn)不同程度的藍(lán)色。表明外源CsCBF1基因在煙草基因組中可以穩(wěn)定表達(dá)。 轉(zhuǎn)基因煙草抗寒性驗證試驗已證實CBF基因可以通過促進(jìn)一系列抗寒基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)增加細(xì)胞內(nèi)的可溶性糖含量，游離脯氨酸和葉綠素含量，減緩膜脂質(zhì)

5、過氧化作用來提高煙草的抗寒能力，本試驗主要從細(xì)胞電解質(zhì)滲透率、膜脂質(zhì)氧化作用、PS Ⅱ反應(yīng)中心光能轉(zhuǎn)化效率和存活率統(tǒng)計方面來證實茶樹CsCBFl的抗寒功能。 分別在25℃，4℃和0℃處理48h后測定生理指標(biāo)。25℃處理下，轉(zhuǎn)pBI121-CsCBF1型、轉(zhuǎn)pBI121型和野生型煙草的膜質(zhì)通透性，丙二醛含量和Fv/Fm均未有顯著差異，而在4℃和0℃處理下，前者的膜質(zhì)通透性和丙二醛含量均顯著低于后兩者，PS Ⅱ反應(yīng)中心光能轉(zhuǎn)化效率(Fv/