IL-2Rα基因負(fù)調(diào)控元件（NRE-NIRS）相關(guān)結(jié)合蛋白的篩選及其功能的初步研究.pdf

1、本研究首先采用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法對(duì)本組從HTLV-I活化的人外周血T淋巴細(xì)胞MATCHMAKERcDNA文庫(kù)中篩選到的NRE結(jié)合蛋白ITF2B在Jurkat細(xì)胞、B3D5細(xì)胞及BJAB細(xì)胞中對(duì)IL-2Rα基因的啟動(dòng)子活性的影響進(jìn)行了研究，并應(yīng)用染色質(zhì)免疫沉淀(ChromatinImmunoprecipitation，ChIP)技術(shù)對(duì)ITF2B在Jurkat細(xì)胞中與IL-2Rα基因啟動(dòng)子區(qū)染色質(zhì)的結(jié)合狀態(tài)進(jìn)行了研究；其次，

2、應(yīng)用酵母單雜交體系從HTLV-1活化的人外周血T淋巴細(xì)胞MATCHMAKERcDNA文庫(kù)中篩選得到了四個(gè)潛在的NIRS結(jié)合蛋白。對(duì)潛在的NIRS結(jié)合蛋白，先用凝膠遷移率變更實(shí)驗(yàn)(Electrophoresismobilityshiftassay，EMSA)證實(shí)了其中三個(gè)在體外能與NIRS序列特異結(jié)合，采用質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染和競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法研究了NFκBactivatingprotein和TTF-I△N320對(duì)IL-2Rα基因的啟動(dòng)子活性

3、的影響。為了更明確NRE和NIRS元件在IL-2Rα基因調(diào)控中的作用，我們還對(duì)NRE和NIRS的核心序列進(jìn)行了定點(diǎn)突變，并構(gòu)建了帶不同IL-2Rα基因啟動(dòng)子(野生型和不同突變型)的報(bào)告基因質(zhì)粒。 一、NIRS樣元件結(jié)合蛋白的篩選、同源性分析及DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域分析以合成的NIRS四聯(lián)體序列介導(dǎo)的報(bào)告質(zhì)粒為“誘餌”，應(yīng)用酵母單雜交體系從HTLV-1活化的人外周血T淋巴細(xì)胞MATCHMAKERcDNA文庫(kù)中篩選到了四個(gè)潛在的NIRS

4、的結(jié)合蛋白。BLASTN和BLASTP分析表明，1號(hào)陽(yáng)性克隆(1＃)的插入片段與人transposon-derivedBusterltransposase-likeprotein基因cDNA有99％的同源性，編碼的多肽與相應(yīng)的蛋白質(zhì)的一致性為96％；2號(hào)陽(yáng)性克隆(2＃)的插入片段與人的Ku抗原(70kD)(Homosapiensthyroidautoantigen70kDa(Kuantigen))cDNA有100％的同源性，編碼的多肽與

5、相應(yīng)的蛋白質(zhì)的一致性為96％；4號(hào)陽(yáng)性克隆(4＃)的插入片段與人RNA聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄終止因子(Homosapienstranscriptionterminationfactor,RNApolymeraseⅠ(TTF-Ⅰ))的cDNA有99％的同源性；編碼的多肽與相應(yīng)的蛋白質(zhì)的一致性為87％；24號(hào)陽(yáng)性克隆(24＃)的插入片段與人一個(gè)可能的NFkB激活蛋白(HomosapiensputativeNFkBactivatingprotein)

6、cDNA有99％的同源性；編碼的多肽與相應(yīng)的蛋白質(zhì)的一致性為92％。 對(duì)插入片段編碼的多肽序列可能的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：編碼與Ku抗原C-端330個(gè)氨基酸殘基同源的克隆(2＃)含有兩個(gè)保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域：Ku78和SAP結(jié)構(gòu)域；編碼與RNA聚合酶Ⅰ的轉(zhuǎn)錄終止因子(TTF-Ⅰ)C-端582個(gè)5氨基酸殘基同源的克隆(4＃)含有兩個(gè)保守的SANT結(jié)構(gòu)域。SAP結(jié)構(gòu)域和SANT結(jié)構(gòu)域都是DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，它們的功能

7、和染色質(zhì)重塑有關(guān)。 二、NIRS結(jié)合蛋白功能的初步研究1.NIRS結(jié)合蛋白與NIRS序列的體外結(jié)合活性我們將三個(gè)陽(yáng)性克隆(Ku70△N284，TTF-I△N320，NFκBAP△N342)的插入片段克隆到真核表達(dá)載體pcDNA6/Flag中構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。Western印跡檢測(cè)的結(jié)果表明，這些真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入HeLa細(xì)胞后可表達(dá)帶Flag標(biāo)簽的融合蛋白。用表達(dá)了融合蛋白的全細(xì)胞抽提物與32P標(biāo)記的帶NIRS樣元件的寡核苷酸探

8、針做凝膠遷移率變更實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，三個(gè)陽(yáng)性克隆插入片段的融合蛋白在體外均能與NIRS樣元件特異結(jié)合。 2.NIRS結(jié)合蛋白TTF-I△N320對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性的影響TTF-I△N320為T(mén)TF-I的截短形式，其C-末端含有兩個(gè)SANT結(jié)構(gòu)域。將其真核表達(dá)質(zhì)粒與不同的IL-2Rα基因啟動(dòng)子(野生型，NRE突變，NIRS突變或雙突變)驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，然后用競(jìng)爭(zhēng)性RT

9、-PCR方法分析IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TTF-I△N320可明顯地降低野生型和NRE突變的IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性，而對(duì)NIRS突變或雙突變的IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性沒(méi)有影響。這提示TTF-I△N320對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性的負(fù)調(diào)控作用依賴NIRS的存在。 3.NIRS結(jié)合蛋白NFκBactivatingprotein對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性的影響將真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA6/Flag-NFκBAP

10、與不同的IL-2Rα基因啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，然后應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法分析IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，NFκBactivatingprotein對(duì)IL-2Rα基因野生型或不同突變型啟動(dòng)子組成性活性都沒(méi)有明顯的影響，而且對(duì)其PHA的誘導(dǎo)活性也沒(méi)有明顯的影響。這提示NFκBactivatingprotein可能對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性沒(méi)有影響。 三、NRE結(jié)

11、合蛋白ITF2B對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性的影響1.ITF2B在Jurkat細(xì)胞中對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性的影響將ITF2B表達(dá)質(zhì)粒分別與受IL-2Rα基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游不同長(zhǎng)度(4k、1.6k、0.5k、0.5kmNRE(NRE核心序列突變)和0.3k)啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因質(zhì)粒(pREP4m-4k-CAT，pREP4m-1.6k-CAT，pREP4m-0.5k-CAT，pREP4m-0.5kmNRE-CAT，pREP4m-0

12、.3k-CAT)及內(nèi)參照質(zhì)粒pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染Jurkat細(xì)胞，然后應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法分析IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，在Jurkat細(xì)胞中ITF2B蛋白可使4k,1.6k,0.5k啟動(dòng)子的組成性活性降低50％，而對(duì)NRE突變或NRE刪除的IL-2Rα基因的啟動(dòng)子活性沒(méi)有明顯的影響。這說(shuō)明在Jurkat細(xì)胞中ITF2B可負(fù)調(diào)控IL-2Rα基因的啟動(dòng)子活性，而且這種負(fù)調(diào)控作用是NRE依賴的。 2.ITF2B在

13、B3D5細(xì)胞中對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性的影響將ITF2B表達(dá)質(zhì)粒與IL-2Rα基因不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因質(zhì)粒及內(nèi)參照質(zhì)粒pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染B3D5細(xì)胞，然后應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法分析IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，在B3D5細(xì)胞中ITF2B蛋白可使4k,1.6k,0.5k啟動(dòng)子的組成性活性降低50％，而對(duì)NRE突變或NRE刪除的IL-2Rα基因的啟動(dòng)子活性沒(méi)有明顯的影響。這說(shuō)明在B3D5細(xì)胞中ITF2B可負(fù)調(diào)

14、控IL-2Rα基因的啟動(dòng)子組成性活性，而且這種負(fù)調(diào)控作用是NRE依賴的。 3.ITF2B在BJAB細(xì)胞中對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性的影響將ITF2B表達(dá)質(zhì)粒與受IL-2Rα基因不同長(zhǎng)度啟動(dòng)子序列驅(qū)動(dòng)的報(bào)告基因質(zhì)粒和內(nèi)參照質(zhì)粒pM-CAT瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染BJAB細(xì)胞，然后應(yīng)用競(jìng)爭(zhēng)性RT-PCR方法分析啟動(dòng)子活性。結(jié)果顯示，與轉(zhuǎn)染空載體的對(duì)照組相比，ITF2B在BJAB細(xì)胞中對(duì)IL-2Rα基因啟動(dòng)子活性沒(méi)有明顯影響。 在Ju

15、rkat細(xì)胞中，IL-2Rα基因呈組成性表達(dá)，而且可被很多刺激因子誘導(dǎo)表達(dá)；B3D5細(xì)胞為一由EB病毒轉(zhuǎn)化可表達(dá)IL-2Rα鏈的的B細(xì)胞株；BJAB細(xì)胞是不表達(dá)IL-2Rα鏈的B淋巴細(xì)胞。ITF2B在Jurkat和B3D5細(xì)胞中可以明顯地降低IL-2Rα基因啟動(dòng)子的組成性活性，而在BJAB細(xì)胞中則不起作用。說(shuō)明這種負(fù)調(diào)控作用具有細(xì)胞特異性，負(fù)調(diào)控作用的發(fā)揮依賴NRE的存在。 4.ITF2B在Jurkat細(xì)胞中對(duì)IL-2Rα基因