生精干細胞移植技術及從胚胎干細胞獲取生殖細胞的研究.pdf

1、生精干細胞移植技術是由美國賓夕發(fā)尼亞大學Brinster教授與其同事在1994年創(chuàng)立的。當年他們把帶有外源基因標記的小鼠的生精干細胞懸液注射進入同系去除內(nèi)源性生精細胞的受體小鼠的曲細精管中，這些供體來源的生精干細胞在受體小鼠的曲細精管中生長分化最終建立了供體來源的精子發(fā)生。在隨后的研究中此項移植技術被不斷延伸用于在不同種屬動物之間進行生精干細胞移植，例如：從大鼠移植到小鼠、從敘利亞金黃倉鼠移植到小鼠、從狗和兔子移植到小鼠、甚至從人移植到

2、小鼠。然而試驗結果表明供體動物和受體動物之間的種系差異越大供體來源的生精干細胞在受體動物曲細精管中形成的精子發(fā)生就越不完全。小鼠睪丸中的支持細胞(Sertolicell)似乎不能支持種系差異比倉鼠還遠的動物的生精干細胞在小鼠曲細精管中生長和分化。 在我們研究的第一部分，我們試圖通過輸出管注射的方法建立生精干細胞移植系統(tǒng)。由于國內(nèi)尚無商品化的帶有外源基因標記的轉基因動物，因此我們采用移植大鼠的生精干細胞到裸鼠睪丸內(nèi)這種方式，以便區(qū)

3、分供體大鼠生精干細胞與受體小鼠內(nèi)原性生精干細胞在同一曲細精管內(nèi)形成的精子發(fā)生。 在進行生精干細胞移植前對4-6周齡的受體裸鼠進行44mg/kgBusulfan腹腔注射，在這個劑量下Busulfan能夠消除受體裸鼠自身的生精細胞。注射四周后裸鼠睪丸曲細精管中已經(jīng)不能看到有明顯的精子發(fā)生的存在，脫落的生精細胞被排出曲細精管。 采用Ⅳcollagenase和typsin-EDTA兩步酶消化法消化機械剪碎的大鼠曲細精管分離單個細

4、胞，單個細胞懸液加入Laminin包被的24孔培養(yǎng)板內(nèi)使生精干細胞與包被的Laminin發(fā)生粘附，在洗去未能粘附的細胞后收集粘附的細胞，并調(diào)整細胞濃度到5×106cells/ml，隨后進行輸出管注射，每只睪丸大約能夠注射10ul細胞懸液。 在生精干細胞移植60-90天后處死受體裸鼠，裸鼠的睪丸在10％中性甲醛中固定24小時，隨后進行石蠟包埋制作切片，石蠟切片在進行periodicacid—Schiff和蘇木素染色后于顯微鏡下觀察

5、。結果表明在接受細胞移植60天和90天的受體裸鼠曲細精管中均存在供體來源的大鼠的精子發(fā)生。由于生精干細胞在篩選到的全部細胞中所占份額甚少，因此未能在受體裸鼠曲細精管中形成大規(guī)模的精子發(fā)生。大鼠精子發(fā)生之所以能夠區(qū)別于小鼠的精子發(fā)生是因為大鼠的長型精子細胞的細胞核的形態(tài)與小鼠的十分不同。大鼠長型精子細胞的細胞核形態(tài)是細長型，類似鐮刀的形態(tài)。然而小鼠的長型精子細胞的細胞核形態(tài)為短粗的逗號樣式，兩者的區(qū)別十分明顯。這個結果表明我們已經(jīng)成功實施

6、了生精干細胞移植。 第二部分從胚胎干細胞獲取生殖細胞的研究 生殖細胞在負責把遺傳信息進行一代代的傳遞的同時也負責使受精卵細胞產(chǎn)生細胞全能性。在很多種動物中，生殖細胞的生成是受預先存在的母系因素所決定的。與此不同，在哺乳動物中，生殖細胞的形成是在胚胎著床后原腸胚形成的時期發(fā)生的。在小鼠中，原始生殖細胞最先出現(xiàn)在受精7.25天的胚胎尿囊的基底部。 用基因定點突變方法所做的基因分析結果表明由靠近外胚層邊緣的胚外外胚層產(chǎn)生

7、的屬于轉化生長因子超家族的骨形成蛋白-4和8b在誘導外胚層細胞向生殖細胞分化的過程中起重要的作用。 近年來，由于采用原始生殖細胞和生殖干細胞進行移植來恢復生殖能力的研究取得了不同程度的成功，這使得科學工作者們產(chǎn)生了促使胚胎干細胞分化為生殖細胞的想法。最近的研究結果表明由小鼠和人的胚胎干細胞形成的擬胚體中包含各種組織的原始細胞，其中的一些細胞表達生殖細胞的表面標志。兩個不同的科研小組成功地分離了這些自發(fā)分化的生殖細胞，并且在體外和

8、體內(nèi)的條件下促使其繼續(xù)分化直至形成精子發(fā)生。 男性不育癥在發(fā)達國家已經(jīng)成為了一個越來越嚴重的社會問題。各種各樣的因素導致了不育癥的發(fā)生，包括：精子數(shù)量嚴重減少、夫妻結婚年齡偏大和性病的流行等。在2003年召開的人類遺傳學大會上很多學者認為使用從胚胎干細胞衍生的配子來治療那些由于不育而不能得到一個帶有自己基因的孩子的夫婦是可行的。 雖然目前有些報道表明胚胎干細胞來源的生殖細胞樣細胞可以在體內(nèi)形成精子發(fā)生，但是在這些研究中胚

9、胎干細胞來源的供體細胞并沒有被移植到受體動物的曲細精管內(nèi)來產(chǎn)生精子發(fā)生。由于曲細精管才是精子發(fā)生的自然部位，因此在本研究中我們計劃從雄性129小鼠胚胎干細胞(ESCell)形成的擬胚體(EB)中分離出SSEA-1陽性細胞并應用retinoicacid(RA)對其進行誘導，最后再把這些細胞移植進入busulfan處理的同系小鼠的曲細精管中來觀察曲細精管提供的微環(huán)境是否能夠影響這些細胞的生長和分化。 根據(jù)以上的結果，我們認為有三個原

10、因能夠在一定的程度上解釋為何移植的細胞未能在受體曲細精管中形成明顯的精子發(fā)生。其一：在進行細胞移植時由ES衍生的PGC樣細胞還沒有完全分化成為生精干細胞，他們需要更長的時間來與曲細精管微環(huán)境進行相互作用以促進分化。45天的時間幾乎等于小鼠的生精干細胞分化為精子所需的必須35天。其二：ES衍生的PGC樣細胞可能處于比較原始的階段，類似于發(fā)育到12.5天的胚胎中的原始生殖細胞的狀態(tài)。它們在具備生精干細胞功能前需要與胚胎生殖脊中的體細胞相互作